Создан биолюминесцентный репортер для отслеживания репарации разрывов ДНК
Исследователи из Массачусетской больницы общего профиля (MGH) и Академии Синика (Тайвань) разработали новый биолюминесцентный репортер для отслеживания репарации двунитевых разрывов ДНК (DSB) в клетках. Система на основе этого нового биолюминесцентного репортера репарации (BLRR) позволяет напрямую отслеживать пути восстановления ДНК как в клеточных линиях, так и в живых организмах. Ранее подобных систем для исследований in vivo не существовало. Эти пути играют ключевую роль при многих состояниях, включая рак.
«Одна из главных причин устойчивости раковых клеток к лечению заключается в их способности восстанавливать повреждения ДНК, вызванные радиацией и химиотерапией», — объясняет Кристиан Элиас Бадр, доктор философии, соавтор статьи. Второй соавтор — Чарльз Пин-Куанг Лай, доктор философии, из Академии Синика.
Исследование было опубликовано в этом месяце в журнале Nucleic Acids Research.
Репарация DSB-повреждений критически важна для поддержания целостности генома и жизнеспособности клетки. Она также играет роль в лечении рака, которое часто включает химиолучевую терапию, повреждающую ДНК. Клетка может распознать повреждение и использовать свой собственный ответ на повреждение ДНК (DDR), чтобы снизить гибель клеток из-за DSB. В результате собственные механизмы репарации раковой клетки могут способствовать лекарственной устойчивости и рецидиву при некоторых злокачественных заболеваниях.
Подход BLRR основан на более ранних работах команды с ферментами люциферазами, которые производят биолюминесценцию и полезны для отслеживания молекул в клетках. BLRR использует секретируемые люциферазы Gaussia и Vargula для детекции гомологи-зависимой репарации (HDR) и негомологичного соединения концов (NHEJ) — двух основных путей репарации DSB. С помощью BLRR исследователи могут отслеживать активность, связанную с HDR и NHEJ, в клетках с течением времени. Система также обнаруживает репарацию DSB в ксенотрансплантированных опухолях in vivo.
«Изучать повреждения ДНК в клетках можно с помощью секвенирования нового поколения (NGS), но это дороже и требует больше времени, — говорит Бадр. — Точность нашей системы сопоставима с NGS».
Исследователи использовали новый репортер для проведения нескольких экспериментов. В одном из них они обнаружили значительную разницу в эффективности редактирования CRISPR/Cas9 с гидовыми РНК, расположенными на расстоянии 1–10 пар оснований друг от друга. Они также использовали BLRR-анализ для обнаружения изменённой динамики репарации DSB, индуцированной низкомолекулярными модуляторами. Наконец, с помощью системы они обнаружили функцию подавления HDR противораковыми сердечными гликозидами в клетках человеческой глиобластомы и глиомных раковых стволовых клетках за счёт ингибирования белка репарации ДНК RAD51 homolog 1.
Авторы описывают систему BLRR как «высокочувствительную платформу для одновременного и долгосрочного отслеживания динамики HDR и NHEJ, которая достаточно универсальна для изучения физиологии и терапевтической разработки репарации DSB». В планах авторов — использование этой репортерной системы для высокопроизводительного скрининга лекарств с целью выявления новых терапевтических средств, повышающих чувствительность раковых клеток к радиации и химиотерапии.