Уловки для уменьшения ошибок ДНК-базового редактора

Исследователи из Центра геномной инженерии Института фундаментальных наук (IBS, Южная Корея) определили частоту ошибок инструментов редактирования ДНК, известных как адениновые базовые редакторы (ABE), основанные на CRISPR. Оценка специфичности этих инновационных методов на уровне всего генома необходима для использования их в клиниках и биотехнологии. Результаты опубликованы в Nature Biotechnology.

Четыре основания ДНК — это алфавит наших клеток: аденин (A) спаривается с тимином (T), цитозин (C) — с гуанином (G), образуя уникальную комбинацию из 3.2 миллиарда букв. Поскольку некоторые генетические заболевания вызваны мутацией всего одной буквы, часть применений CRISPR — мощного инструмента генной инженерии — связана с исправлением этой однонуклеотидной разницы. Примеры белков, которые можно добавить к системе CRISPR для преобразования букв, — цитозиновые базовые редакторы (CBE) для конверсии C в T и адениновые базовые редакторы (ABE) для изменения A на G. Команда IBS сосредоточилась на изучении специфичности ABE, так как она ранее не была известна.

Команда под руководством Джин-Су Кима изучила частоту ошибок недавно разработанного белка ABE7.10 в человеческих клетках. Они определили позиции в геноме человека, на которые воздействует ABE7.10, и просканировали наличие ошибок вне целевого сайта. Для этого использовалась адаптированная версия метода секвенирования Digenome-seq, разработанного тем же исследовательским центром и ранее успешно применявшегося для оценки точности CBE, CRISPR/Cas9 и CRISPR/Cpf1.

Они протестировали ABE7.10 с семи гидовыми РНК, соответствующими семи целевым последовательностям ДНК, и сравнили результаты с обычным CBE и нуклеазой Cas9. Модифицированный Digenome-seq обнаружил в среднем 60 внецелевых ошибок во всем человеческом геноме. Интересно, что хотя три белка были сконструированы для нацеливания на один и тот же сайт, они распознали разные внецелевые точки.

Биологи IBS также показали некоторые стратегии для сокращения числа внецелевых модификаций:

• Добавление пары G на конец гидовой РНК уменьшило количество внецелевых ошибок.
• Использование другого типа Cas9 (Sniper-Cas9, разработанного той же командой в 2018 году) также повысило точность.
• Доставка ABE7.10 в виде преассемблированных рибонуклеопротеинов, а не с помощью плазмид, дала аналогичный эффект.

Команда нацелена на развитие ABE для внесения желаемых однонуклеотидных изменений более точно и эффективно. «Поскольку точность базового редактора доказана, мы ожидаем, что он найдет широкое применение в будущем в медицинской и сельскохозяйственной сферах», — говорит Джин-Су Ким.