Метод точной коррекции ошибок в ДНК подтвердил свою эффективность

Исследователи из Института фундаментальных наук (IBS) подтвердили точность недавно разработанного метода редактирования генов. Он работает как «ножницы для ДНК», способные найти и заменить всего один нуклеотид среди 3 миллиардов. «Впервые точность этого базового редактора была проверена на уровне всего генома», — объясняет ведущий автор исследования КИМ Джин-Су. Эта валидация, опубликованная в Nature Biotechnology, поможет расширить применение метода в сельском хозяйстве, животноводстве и генной терапии.

Основной технологией редактирования ДНК третьего поколения является CRISPR — инструмент, который быстрее и дешевле своих предшественников. Вырезая небольшую последовательность ДНК, CRISPR-Cas9 и CRISPR-Cpf1 используются для «выключения» или снижения экспрессии дефектных генов. Однако в прошлом году биологи открыли новый метод базового редактирования, который не вызывает случайных делеций и вставок в ДНК, а заменяет только одно азотистое основание. Такие исправления критически важны, поскольку многие заболевания вызваны ошибкой в одном из четырёх «букв» ДНК: аденине (A), цитозине (C), гуанине (G) и тимине (T). Ошибки в одном нуклеотиде называются точковыми мутациями. К состояниям, вызванным такими мутациями, относятся муковисцидоз, серповидноклеточная анемия и дальтонизм.

В отличие от существующих технологий, метод базового редактора представляет собой модификацию CRISPR-Cas9 (nCas9, никаза), сшитую с ферментом цитидиндезаминазой, который заменяет основание C на T. «Ножницы» направляются в нужное место на ДНК с помощью направляющей РНК. Однако до недавнего времени не было известно, работает ли редактор только в области целевого гена или же он также заменяет основания C в нецелевых участках генома.

Всего через месяц после первого успешного сообщения о базовом редактировании в животных (Nature Biotechnology) для изменения одного нуклеотида в генах дистрофина и тирозиназы, та же команда продемонстрировала точность этого метода в масштабе всего генома.

Чтобы проверить надёжность метода, исследователи IBS модифицировали метод проверки на ошибки Digenome-seq, адаптировав его для базового редактора. Digenome-seq был использован и подтверждён в прошлом году, когда команда анализировала точность CRISPR-Cpf1 и Cas9. Исследователи также улучшили компьютерную программу Digenome 2.0 для более полного выявления нецелевых эффектов и сравнили разные направляющие РНК, чтобы найти ту, которая снижает ошибки и повышает специфичность.

Используя эту технику, команда обнаружила, что метод базового редактирования даже точнее, чем CRISPR-Cas9 третьего поколения. Метод базового редактирования вызывал замены C на T в нескольких сайтах генома человека, в то время как CRISPR-Cas9 вызывал разрывы в нескольких сайтах. Это означает, что новый метод базового редактора вносит меньше нецелевых изменений. «Следовательно, ожидается, что эти базовые редакторы будут использоваться так же широко, как и популярная технология CRISPR», — говорит КИМ.