Редактирование ДНК вызывает значительные побочные мутации в РНК
В исследовании, опубликованном в Nature 10 июня, учёные из лаборатории доктора Ян Хуэй в Институте нейробиологии Китайской академии наук (CAS) и их коллеги из CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology и Сычуаньского университета показали, что редакторы оснований ДНК генерируют десятки тысяч побочных однонуклеотидных вариантов (SNV) в РНК. Эти побочные SNV можно устранить, вводя точечные мутации в деаминазы.
Исследование выявило ранее упускаемый из виду аспект риска редакторов оснований ДНК и предложило решение проблемы путём модификации деаминаз.
Методы редактирования оснований ДНК позволяют напрямую корректировать точечные мутации в геномной ДНК без образования двуцепочечных разрывов (DSB), но потенциальные побочные эффекты ограничивают их применение. Аденовирусные векторы (AAV) — наиболее распространённая система доставки для генной терапии с редактированием ДНК. Поскольку эти вирусы могут обеспечивать долгосрочную экспрессию гена in vivo, степень потенциальных побочных эффектов на уровне РНК, вызванных редакторами ДНК, вызывает серьёзную озабоченность для их клинического применения.
Несколько предыдущих исследований оценивали побочные мутации в геномной ДНК, вызванные редакторами оснований. При этом деаминазы, входящие в состав широко используемых редакторов, часто проявляют активность связывания с РНК. Например, было обнаружено, что цитозиндеаминаза APOBEC1, используемая в цитозиновых редакторах оснований (CBE), нацелена как на ДНК, так и на РНК, а адениндеаминаза TadA, используемая в адениновых редакторах оснований (ABE), вызывает сайт-специфичное образование инозина на РНК. Однако потенциальные мутации РНК, вызванные редакторами ДНК, ранее не оценивались.
Чтобы оценить побочный эффект редакторов ДНК на уровне РНК, исследователи подсчитали количество побочных SNV РНК в каждой реплике клеток, обработанных CBE или ABE, и изучили возможность их устранения путём модификации деаминаз.
Они трансфицировали один тип CBE (BE3, APOBEC1-nCas9-UGI) или ABE (ABE7.10, TadA-TadA*-nCas9) вместе с GFP и с направляющей РНК (sgRNA) или без неё в культивируемые клетки HEK293T. После подтверждения высокой эффективности редактирования ДНК как BE3, так и ABE7.10 в этих клетках, они провели РНК-секвенирование со средней глубиной 125X и количественно оценили SNV РНК в каждой реплике.
Эффективность целевого редактирования оценивалась в каждой реплике, чтобы гарантировать его успешность. Затем количество побочных SNV РНК в группах, обработанных CBE и ABE, сравнили с контрольной группой (только GFP). Было обнаружено поразительно большее количество SNV РНК в клетках, обработанных редакторами ДНК.
Кроме того, исследователи обнаружили, что предпочтения в мутациях в клетках, обработанных BE3 или ABE7.10, совпадали с таковыми у APOBEC1 или TadA соответственно, что указывает на то, что побочные эффекты вызваны сверхэкспрессией редакторов ДНК. Также были идентифицированы специфичные для CBE и ABE мотивы и генетические области этих побочных SNV РНК.
Чтобы устранить побочную активность редакторов на уровне РНК, они изучили эффект введения точечных мутаций в APOBEC1 или TadA. Три высокоточных варианта — BE3W90Y+R126E, BE3 (hA3AR128A) и BE3 (hA3AY130F) — снизили количество побочных SNV РНК до базового уровня. Аналогично, вариант ABE ABE7.10F148A также показал полное устранение побочных эффектов.
Это исследование позволило получить высокоточные варианты как для CBE, так и для ABE путём введения точечных мутаций в деаминазы и предложило метод рационального конструирования для повышения специфичности редакторов оснований.