Улучшенный метод генного редактирования в грибах с помощью CRISPR/Cas9
Исследователи из Токийского университета науки, Университета Мэйдзи и Токийского университета сельского хозяйства и технологий под руководством доктора Такаюки Аразое и профессора Шигеру Куваты разработали новые стратегии для повышения эффективности редактирования генома в грибе Pyricularia (Magnaporthe) oryzae (возбудитель пирикуляриоза риса) с использованием системы CRISPR/Cas9. Их работа опубликована в Scientific Reports.
Новые стратегии включают:
- Быстрое (одноэтапное) введение генов.
- Использование очень коротких гомологичных последовательностей (всего 100 пар оснований).
- Возможность обхода ограничений, связанных с определенными последовательностями-шаблонами (PAM) в ДНК хозяина.
Суть метода и ключевые результаты:
Нарушение работы гена (нокаут): Ученые создали вектор на основе CRISPR/Cas9 для направленного нарушения гена scytalone dehydratase (SDH), участвующего в синтезе меланина. Разрыв ДНК системой CRISPR/Cas9 запускал в клетках гриба механизм репарации — гомологичную рекомбинацию (HR) кроссоверного типа. Это привело к вставке всего вектора с геном устойчивости к гигромицину B (hph) в целевой участок. Мутанты с нарушенным геном SDH легко идентифицировались как белые колонии (из-за отсутствия меланина) на среде с антибиотиком. Эффективность процесса резко возросла при использовании вектора CRISPR/Cas9.
Введение нового гена (нокаут): По аналогичной стратегии исследователи успешно провели одноэтапное введение гена зеленого флуоресцентного белка (GFP) в геном гриба. На среде с гигромицином B появлялись зеленые флуоресцентные колонии, что подтвердило эффективность метода.
Значение исследования:
- Гибкость: Технология преодолевает ограничение, накладываемое необходимостью наличия PAM — один из главных недостатков системы CRISPR/Cas9, что позволяет проводить более гибкое редактирование генома.
- Скорость и эффективность: Метод позволяет проводить быстрое одноэтапное введение генов с высокой эффективностью, используя уникальную особенность нитчатых грибов — частую индукцию кроссоверов даже в соматических клетках при разрезе целевой ДНК.
- Применение: Разработанная методика ускорит молекулярно-биологические исследования патогена риса, что может способствовать стабильности продовольственного снабжения. Она также применима к другим промышленно важным нитчатым грибам в биотехнологической, пищевой и ферментационной отраслях.
Как отмечают авторы: «Растения и их патогены продолжают совместную эволюцию в природе. Использование механизмов мутаций у модельных патогенных грибов в качестве метода редактирования генома может привести к разработке дальнейших новых технологий в генной инженерии».