Новая CRISPR-диагностика для пациентов с пересаженной почкой

Международная исследовательская группа разработала новый диагностический тест, сочетающий простоту взятия пробы мочи с высокочувствительными сенсорными возможностями CRISPR. Тест предназначен для мониторинга пациентов с пересаженной почкой и описан в журнале Nature Biomedical Engineering.

Тест выявляет две распространённые оппортунистические вирусные инфекции у таких пациентов — цитомегаловирус (CMV) и BK-полиомавирус (BKV), — а также мРНК CXCL9, уровень которой повышается при острой клеточной реакции отторжения трансплантата.

Решение критической задачи

Пациенты после трансплантации почки принимают иммуносупрессанты, чтобы снизить риск отторжения органа. Это повышает их уязвимость к инфекциям. Текущий мониторинг инфекций и отторжения обычно проводится с помощью анализов крови и биопсии почки — методов, которые более инвазивны, требуют времени и дороги.

CRISPR-технология способна находить очень малые фрагменты последовательности ДНК или РНК. В диагностике она работает в связке с белками Cas, которые расщепляют мишень, и флуоресцентным репортёрным белком. Высвобождение флуоресценции указывает на наличие цели.

«Сложность заключается в достижении клинически значимых концентраций», — отмечает доктор Михаэль Камински, руководивший разработкой теста. — «Есть огромная разница между обнаружением большого количества синтетической мишени в пробирке и достижением уровня одной молекулы в биологической жидкости пациента».

Принцип работы теста

Тест-система (assay) использует двухэтапный процесс:

1. Амплификация: вирусная ДНК-мишень в образце мочи многократно копируется, чтобы CRISPR мог её обнаружить даже при наличии одной молекулы. Команда использовала специфический CRISPR-Cas13 протокол SHERLOCK.
2. Детекция: результат отображается на бумажной полоске, как в домашнем тесте на беременность. Одна линия — результат отрицательный, две линии — вирус присутствует.

Для случаев очень низкой концентрации мишени, когда вторая линия на полоске бледная, команда разработала приложение для смартфона. Оно объективно анализирует фотографию тест-полоски и выносит окончательное решение на основе интенсивности линии.

Для маркера отторжения CXCL9 использовался аналогичный процесс: выделение и амплификация мРНК с последующей детекцией мишени с помощью CRISPR-Cas13.

Результаты и перспективы

После оптимизации методики исследователи проанализировали более 100 образцов от пациентов с пересаженной почкой. Тест показал высокую точность даже при низком уровне инфекции BKV или CMV и правильно определял признаки острого клеточного отторжения трансплантата.

В настоящее время подана заявка на патент. Доктор Камински, будучи врачом и клиническим исследователем, планирует более масштабные клинические исследования для сравнения теста с традиционными методами мониторинга. Следующая цель — сделать тест более простым (сейчас он требует нагревания образца и состоит из нескольких этапов) и перейти к одноэтапному процессу для количественного измерения нескольких параметров. Это позволит пациентам отслеживать изменения относительно их индивидуальных базовых показателей.

Такой тест также может быть полезен для других людей с ослабленным иммунитетом, а CRISPR-диагностический подход потенциально можно адаптировать для мониторинга после трансплантации других органов.