CRISPR-Cascade: тест для выявления инфекций крови за минуты без амплификации
Исследователи из Университета Иллинойса разработали диагностический инструмент на основе CRISPR, способный обнаруживать инфекции кровотока за минуты без необходимости амплификации нуклеиновых кислот. Анализ CRISPR-Cascade достигает аттомолярной чувствительности и включает функцию логического ИЛИ для одновременной идентификации нескольких патогенов по их ДНК.
Стандартные методы диагностики инфекций кровотока, такие как ПЦР (PCR) и изотермическая амплификация, требуют времени. CRISPR-инструменты, например SHERLOCK и DETECTR, улучшили специфичность, но всё ещё зависят от стадии амплификации, что ограничивает скорость.
В исследовании, опубликованном в PNAS, учёные проверили, может ли CRISPR-система с петлёй обратной связи детектировать патогенную ДНК в ультранизких концентрациях без амплификации.
Как работает реакция CRISPR-Cascade:
- Использует два рибонуклеопротеиновых комплекса: T1 и T2.
- При связывании с мишенью (ДНК патогена) белок Cas12a в комплексе T1 расщепляет «заблокированные» нуклеиновые кислоты.
- Это высвобождает «клеточную» РНК, которая активирует дополнительные ферменты Cas12a в комплексе T2.
- Запускается самоподдерживающаяся петля обратной связи, приводящая к флуоресцентному сигналу.
Система обеспечивает обнаружение с аттомолярной чувствительностью в течение 10 минут. Оптимизация температуры реакции (33°C) и кинетики ферментов повысила специфичность.
Результаты тестирования:
Анализ успешно идентифицировал в образцах крови:
- Methicillin-Sensitive Staphylococcus aureus (MSSA)
- Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA)
- Escherichia coli (E. coli)
- Вирус гепатита B
Функция логического ИЛИ позволила обнаруживать несколько патогенов в одной реакции.
Сравнение скорости с другими методами:
Традиционный посев с ПЦР: 24–72 часа
ПЦР без посева: 3–6 часов
Быстрые ПЦР-методы: ~1 час
CRISPR-Cascade (включая пробоподготовку): ~30 минут
Потенциальные области применения включают диагностику инфекционных заболеваний, тестирование у постели больного (point-of-care) и персонализированную медицину.