Ученые преодолели ключевое препятствие для редактирования генома CRISPR-Cas9
Исследователи из Broad Institute (MIT и Гарвард) и McGovern Institute for Brain Research (MIT) внесли изменения в революционную систему редактирования генома CRISPR-Cas9, которые значительно сокращают ошибки редактирования «вне мишени» (off-target). Усовершенствованная методика решает одну из главных технических проблем в использовании редактирования генома.
Система CRISPR-Cas9 работает, внося точно направленное изменение в ДНК клетки. Белок Cas9 разрезает ДНК в месте, заданном короткой РНК, последовательность которой соответствует целевому участку. Хотя Cas9 известен высокой эффективностью разрезания своей мишени, главным недостатком системы было то, что, попав в клетку, он может связываться и разрезать дополнительные, нецелевые сайты. Это может привести к нежелательным изменениям, которые нарушат экспрессию генов или полностью «выключат» ген, что способно вызвать развитие рака или других проблем.
В статье, опубликованной в журнале Science, Фэн Чжан и его коллеги сообщают, что замена трех из примерно 1400 аминокислот, составляющих фермент Cas9 из S. pyogenes, резко снизила «офф-таргет редактирование» до неопределяемого уровня в исследованных конкретных случаях.
Ученые использовали знания о структуре белка Cas9, чтобы уменьшить нецелевое разрезание. Отрицательно заряженная ДНК связывается с положительно заряженным участком (бороздкой) в белке Cas9. Зная структуру, исследователи предположили, что замена некоторых положительно заряженных аминокислот на нейтральные ослабит связывание с «офф-таргет» последовательностями в большей степени, чем с целевыми.
После экспериментов с различными вариантами команда Чжана обнаружила, что мутации в трех аминокислотах резко сокращают нецелевые разрезы. Для проверенных направляющих РНК нецелевое разрезание было настолько низким, что его не удалось обнаружить.
Новый инженерный фермент, названный командой «улучшенным» Cas9 из S. pyogenes (eSpCas9), будет полезен для приложений редактирования генома, требующих высокого уровня специфичности. Лаборатория Чжана немедленно предоставляет фермент eSpCas9 исследователям по всему миру. Команда полагает, что тот же подход с изменением заряда будет работать и с другими недавно описанными РНК-направляемыми ферментами для нацеливания на ДНК, включая Cpf1, C2C1 и C2C3.
Перспектива быстрого и эффективного редактирования генома поднимает множество этических и социальных вопросов, отмечает Чжан, выступающий на Международном саммите по редактированию генов в Вашингтоне. «Многие проблемы безопасности связаны с эффектами вне мишени, — сказал он. — Мы надеемся, что разработка eSpCas9 поможет решить некоторые из этих проблем, но мы, конечно, не считаем это волшебной пулей. Эта область развивается быстрыми темпами, и нам еще многое предстоит узнать, прежде чем мы сможем рассматривать применение этой технологии в клинической практике».