Идентифицированы препараты, блокирующие геномное редактирование CRISPR-Cas9
Ученые сообщают об открытии первых низкомолекулярных ингибиторов белка Cas9 из Streptococcus pyogenes (SpCas9), что может обеспечить более точный контроль над технологиями редактирования генома на основе CRISPR-Cas9.
Исследователи разработали комплекс высокопроизводительных биохимических и клеточных анализов, чтобы проскринировать разнообразную библиотеку малых молекул и найти соединения, нарушающие связывание SpCas9 с ДНК и блокирующие его способность разрезать ДНК. Эти первые низкомолекулярные ингибиторы CRISPR-Cas9 легко проникают в клетки и значительно меньше ранее открытых анти-CRISPR белков. Новые соединения позволяют осуществлять обратимый и дозозависимый контроль над технологиями на основе SpCas9, включая его применение для редактирования генов, базового редактирования и эпигенетического редактирования в клетках млекопитающих.
В настоящее время SpCas9 разрабатывается как агент для генной терапии множества заболеваний, включая ВИЧ, нарушения зрения, мышечную дистрофию и другие наследственные расстройства. Однако этим терапевтическим применениям крайне необходим точный контроль над дозой и временем активности SpCas9 для снижения нецелевых эффектов. Такой контроль также полезен для других приложений, например, для эффективного редактирования ДНК модельных организмов или использования ген-драйвов в генетически модифицированных комарах для сдерживания распространения малярии.
Потребность в контроле создала спрос на анти-CRISPR молекулы. Существующие анти-CRISPR белки, нацеленные на SpCas9, велики, не проникают в клетки, действуют необратимо, могут расщепляться протеазами и несут риск нежелательных иммунных реакций. В отличие от них, низкомолекулярные ингибиторы протеолитически стабильны, обратимы, как правило, неиммуногенны и легко доставляются в клетки путем пассивной диффузии.
В новом исследовании команда представила надежную, чувствительную и масштабируемую платформу для быстрой и экономичной идентификации и валидации низкомолекулярных ингибиторов SpCas9. Для первичного анализа они использовали метод флуоресцентной поляризации для мониторинга взаимодействия между SpCas9 и меченным флуорофором сегментом ДНК, содержащим PAM-последовательности. Для вторичного анализа применялась автоматизированная микроскопия для измерения изменений флуоресценции, вызванных разрезанием ДНК репортерного гена SpCas9 в клетках.
С помощью этих анализов ученые идентифицировали два ведущих соединения, которые нарушают способность SpCas9 связывать ДНК и ингибируют опосредованное SpCas9 разрезание ДНК в клетках млекопитающих дозозависимым образом. Поскольку они блокируют связывание фермента с ДНК, эти молекулы также ингибируют каталитически ослабленные технологии на основе SpCas9, включая технологии для активации транскрипции, и стабильны в человеческой плазме.
В будущих исследованиях ученые планируют определить сайты связывания ингибиторов на комплексе SpCas9:gRNA, изучить их механизм действия и оптимизировать их эффективность. Они также оценят специфичность молекул в отношении других CRISPR-ассоциированных нуклеаз. Предварительные результаты указывают, что молекулы достаточно специфичны к своей мишени, так как не влияют на отдаленно родственный CRISPR-фермент Cas12a.