Термостабильный фермент Cas13 может улучшить диагностику и создать новые биотехнологические применения

Белок из термофильной бактерии позволяет специфично детектировать SARS-CoV-2 и другие вирусы в одностадийном анализе на основе технологии RT-LAMP. Этот тест может упростить диагностику COVID-19 и других инфекций в местах оказания медицинской помощи.

Тесты RT-LAMP похожи на ПЦР: они обнаруживают крошечные количества вирусного генетического материала в образце, амплифицируя его до детектируемых количеств. Одно преимущество RT-LAMP перед ПЦР заключается в том, что он проводится при одной температуре (55–65 градусов Цельсия), а не при циклическом изменении температур. Это делает его быстрее и проще в использовании. Однако его недостаток — меньшая точность по сравнению с ПЦР, так как он может давать ложноположительные результаты.

«Если бы с RT-LAMP можно было связать дополнительный фактор специфичности, чтобы различать истинную и ложную амплификацию, это помогло бы разработать мощные диагностические технологии», — говорит аспирант KAUST Ахмед Махас.

Махас и команда учёных из лаборатории Магди Махфуза хотели найти систему CRISPR-Cas, которую можно было бы использовать с RT-LAMP для специфичного обнаружения целевого генетического материала в одностадийном анализе без необходимости в новых реагентах. Белки Cas — это линия защиты бактерий от вторжения патогенов, и их использовали для обнаружения амплифицированной РНК. Однако большинство РНК-таргетных белков Cas13 функционируют при температуре около 37 градусов Цельсия, что несовместимо с RT-LAMP. Команда хотела найти фермент Cas13, который нацелен на вирусную РНК и стабилен при температурах, используемых в тестах RT-LAMP.

Изучая базы данных белков Cas, они нашли перспективного кандидата, принадлежащего термофильной (любящей тепло) бактерии Herbinix hemicellulosilytica. Дальнейший поиск в белковых базах данных выявил ещё один белок Cas со сходной генетической последовательностью у термофила Thermoclostridium caenicola. Тесты показали, что оба белка Cas стабильны при относительно высоких температурах, но белок TccCas13a, принадлежащий T. caenicola, оставался стабильным в более широком диапазоне (37–70 градусов Цельсия).

После дальнейших тестов и оптимизаций команда смогла использовать TccCas13a для разработки чувствительного, надёжного и быстрого одностадийного анализа под названием OPTIMA-dx.

Тест использует RT-LAMP для амплификации количества целевых вирусных РНК в образце. Затем TccCas13a распознаёт и разрезает её, активируясь для разрезания специальных флуоресцентно меченых РНК, добавленных в смесь. Это создаёт флуоресцентный сигнал, который можно считать с помощью мобильного приложения, также разработанного командой.

OPTIMA-dx успешно обнаружил SARS-CoV--2 в образцах пациентов. Его также модифицировали для обнаружения других вирусов, таких как гепатит C, или даже нескольких вирусов одновременно. Технология запатентована, создан прототип и проведена клиническая валидация. Команда сейчас переводит продукт в стартап-фазу с целью массового производства и коммерциализации.

«Найти термостабильный фермент TccCas13a — это только начало, — говорит Махфуз. — Сейчас мы исследуем другие системы, чтобы разработать биологически вдохновлённые прорывные технологии для здравоохранения, терапии и диагностики».

Исследование опубликовано в Proceedings of the National Academy of Sciences.