'Скоростной сканер' позволяет одновременно тестировать тысячи генетических переключателей растений
Сельское хозяйство с самого начала стало возможным благодаря тому, что люди изменяли гены растений, чтобы они росли быстрее, давали больше желаемой продукции и выживали в условиях засухи, вредителей и инфекций. Тысячелетиями это делалось с помощью селекции. Совсем недавно мы перешли к генной инженерии. Но даже с современными сверхбыстрыми технологиями секвенирования и оптимизированными инструментами редактирования генов на основе CRISPR успешное изменение растения остается медленным и трудоемким процессом.
Ученые из Объединенного института биоэнергетики (JBEI) помогают изменить это с помощью новой технологии ENTRAP-seq, которая может одновременно скринировать тысячи транскрипционных регуляторов растений. Транскрипционные регуляторы — это белки, которые влияют на экспрессию гена, подобно диммерному переключателю света: они могут полностью выключить ген или изменить количество производимого клеткой продукта, модулируя частоту транскрипции ДНК в РНК.
Большинство улучшенных признаков у современных сельскохозяйственных и биоэнергетических видов — результат модуляции транскрипции. Например, тысячи лет назад древние фермеры вывели естественные варианты пшеницы с более высокой экспрессией генов, контролирующих размер зерна. Ученым в области агротехнологий хотелось бы лучше управлять этими генетическими переключателями, но наше понимание их ограничено, несмотря на обширные исследования геномов растений.
"Даже для хорошо изученных растений — где мы много знаем о том, какие гены что контролируют и, во многих случаях, как работает ген — неясно, как изменить экспрессию гена, чтобы сделать полезные модификации", — сказал Саймон Аламос, постдок в Калифорнийском университете в Беркли и JBEI, исследовательском центре биоэнергетики Министерства энергетики США (DOE), которым управляет Национальная лаборатория Лоуренса в Беркли (Berkeley Lab).
Аламос — соавтор исследования, описывающего ENTRAP-seq, опубликованного в Nature Biotechnology. "Мы хотим иметь возможность использовать собственные транскрипционные регуляторы растений и белки с такой активностью из других организмов, например, растительных вирусов, но до сих пор у нас не было способа предсказать, что они делают, или быстро их протестировать".
ENTRAP-seq удовлетворяет эту потребность, сокращая эксперименты, которые ранее требовали целого растения или целого листа, до одной клетки. Процесс использует бактерию, инфицирующую растения, для вставки последовательностей ДНК для многих потенциальных белков-транскрипционных регуляторов в лист вместе с кодом для сконструированного целевого гена.
Ученые создают библиотеку из тысяч бактерий, каждая из которых содержит инструкции для одного белкового варианта. Затем бактериальную библиотеку вводят в лист, и каждая бактерия передает свой генетический груз одной растительной клетке, так что тысячи различных вариантов производятся разными отдельными клетками растения.
Как только растительная клетка создала эти компоненты, белковые варианты могут включать или выключать молекулярные переключатели внутри ядра клетки, сигнализируя об их активирующих или репрессорных свойствах. Если вариант обладает активирующими свойствами, будет экспрессирован сконструированный ген, специально разработанный для связывания с магнитными молекулами-метками. Затем ученые могут использовать магниты для физической изоляции клеток, которые произвели целевой белок, секвенировать ДНК внутри и сопоставить результаты со списком потенциальных белков, которые они ввели.
После разработки подхода команда продемонстрировала его беспрецедентную скорость для реальных исследований. Они использовали ENTRAP-seq для изучения регуляции гена в транскрипционном активаторе, который, как известно, опосредует экспрессию гена, контролирующего цветение у Arabidopsis — растения, используемого в качестве модельного организма для ботанических исследований. Они создали 350 мутантных версий белка и быстро проскринировали, какие из них могут ускорять или замедлять время цветения.
"Этот эксперимент занял всего несколько недель. Для сравнения, в предыдущем исследовании наша команда охарактеризовала активность 400 растительных транскрипционных регуляторов, что заняло у двух человек полный рабочий день в течение двух лет с использованием традиционного, "грубого" подхода, тестируя варианты по одному", — сказал ведущий автор Патрик Ши, заместитель вице-президента по подразделению сырья и директор по дизайну растительных биосистем в JBEI.
Раскрытие коммутационной панели
Ши и его команда сгенерировали потенциальные конструкции активаторов для этого исследования, используя существующую модель ИИ, которая идентифицирует последовательности ДНК, которые могут кодировать белки, активирующие гены, у любого организма.
"Прогнозы модели позволили нам сосредоточить наши экспериментальные усилия на наиболее информативных белках из тысяч геномов", — сказал соавтор Лукас Вальдбургер, аспирант-исследователь в Калифорнийском университете в Беркли и JBEI.
Однако точность этой модели ограничена нехваткой обучающих данных, потому что, как ученым известно из первых рук, методы исследования транскрипционных регуляторов раньше были мучительно медленными. С помощью ENTRAP-seq исследователи смогут быстро генерировать огромные наборы данных, которые могут улучшить эти модели.
А лучшие модели означают, что исследователи смогут быстро сканировать геном растения и обнаруживать, где закодированы все генетические переключатели — информация, которой почти нет для многих видов. Затем, замыкая положительную обратную связь, ENTRAP-seq поможет ученым изучать эффекты естественных и сконструированных вариаций этих белков, чтобы создавать версии, улучшающие желаемые признаки.
"Мы ищем все переключатели и хотим знать: это переключатели "вкл/выкл"? А затем: насколько высоко и низко они могут работать? Каталогизация всего этого будет огромным прорывом", — сказал Ши, который также является адъюнкт-профессором в Калифорнийском университете в Беркли и научным сотрудником в области бионаук в Berkeley Lab. "А потом, возможно, мы найдем важный переключатель для создания более крупных растений, более высокой урожайности или более устойчивых к стрессу культур, и, наконец: сможем ли мы выкрутить этот диммер на максимум?"