Исследователи создали ловушку для захвата и сравнения отдельных бактериальных клеток
Больницы по всему миру борются с невидимой угрозой — бактерией Pseudomonas aeruginosa. Она поражает тысячи пациентов ежегодно в отделениях интенсивной терапии, вызывая сепсис, пневмонию и другие инфекции.
Для здорового человека P. aeruginosa не представляет серьёзной угрозы, но для наиболее уязвимых пациентов — с ослабленным иммунитетом, на ИВЛ или с серьёзными ожогами — она смертельно опасна. Это связано с её сложными механизмами защиты: устойчивостью к антибиотикам, способностью образовывать защитные биоплёнки, приобретать резистентность от других организмов и даже вырабатывать цианид для уничтожения конкурентов.
Выход за рамки чашки Петри
Профессор Джошуа Шраут и профессор Пол Бон из Университета Нотр-Дам начали совместную работу над новыми методами наблюдения за микроорганизмами, выходящими за рамки традиционного культивирования в чашке Петри. Они сосредоточились на изучении индивидуальных клеток, а не усреднённого поведения популяции.
"Представьте, что вы слушаете сверчков на крыльце. Влияют на вас только те, кто стрекочет. В популяциях бактерий тоже есть вариации, но у большинства микробиологов нет инструментов, чтобы оценить влияние этих "меньшинств"", — пояснил Шраут.
Для экспериментов нужно было решить три задачи: захватить отдельные клетки, применить к ним одинаковый стимул одновременно и наблюдать за их реакцией в реальном времени.
Создание улучшенной бактериальной ловушки
Аспирант Эллисон Кутри и постдок Виньеш Сундаресан разработали основу устройства в чистой комнате Nanofabrication Facility Нотр-Дама. Платформа создавалась послойно, как микрочип: слой эпоксидной смолы, покрытый с двух сторон тонким золотым напылением для подведения электричества к целевым точкам на бактерии.
С помощью сфокусированного ионного пучка в устройстве было проделано более 100 микропор диаметром менее 1 микрона (примерно в 50 раз тоньше человеческого волоса), чтобы в каждую могла проскользнуть одна бактерия.
Используя склонность P. aeruginosa прилипать к поверхностям, исследователи смогли загнать отдельные клетки в микропоры. Затем, подавая электрические заряды через золотые слои, они наблюдали за экспериментом через флуоресцентный микроскоп, настроенный на определённый класс бактериальных молекул.
Наблюдаемое свечение из лунок подтвердило успешную загрузку устройства бактериями. В ходе тестов выявились три паттерна реакции клеток на заряд: одни светились синхронно с ним, другие — с перерывами, а третьи — независимо от заряда.
"Мы до сих пор не уверены, какие ещё различия существуют или что они значат для борьбы с P. aeruginosa", — сказал Шраут.
Дальнейшие исследования показали схожие паттерны у другого типа бактерий — E. coli. Также было установлено, что метаболическое состояние клетки (поглощает она или расходует энергию) играет ключевую роль в формировании её поведения.
Исследователи надеются, что наблюдаемые паттерны и созданное устройство, описанное в журнале Cell Reports Physical Science, вдохновят аналогичные проекты.
"Мы давно знали, что P. aeruginosa проявляет флуоресцентное поведение в ответ на заряд. Но чтобы увидеть всё разнообразие реакций клеток, нужен инструмент для наблюдения за ними по отдельности. Существующие методы маскируют эти различия", — объяснила Кутри.
"Как исследователю, приятно не только задавать новые вопросы, но и создавать новые инструменты и платформы, которые делают эти вопросы возможными. Объединив знания о поведении клеток с нанотехнологиями и высокоразрешающей визуализацией, мы смогли это сделать в рамках данного проекта", — добавил Шраут.