Хемотаксис

Хемотаксис — это направленное движение бактерий, клеток крови или других клеток по градиенту концентрации определённых химических веществ (см. Хемоаттрактанты). Это явление лежит в основе многих биологических процессов, от поиска пищи бактериями до работы иммунной системы.

Роль в иммунитете и диагностике

Хемотаксическая активность лейкоцитов и хемоаттрактантная активность крови и других биологических жидкостей организма служат важными показателями состояния иммунной системы. Способность иммунных клеток (мононуклеаров и полиморфноядерных лейкоцитов, ПЯЛ) реагировать на химический сигнал, активно перемещаться и накапливаться в очаге поражения во многом определяет скорость развития, интенсивность и исход воспалительного процесса.

Для определения хемотаксиса лейкоцитов разработано несколько методик. Наиболее распространён метод Бойдена, описанный ниже.

Метод Бойдена

Метод основан на способности лейкоцитов активно проникать через пористую мембрану в направлении градиента концентрации хемоаттрактанта.

Принцип работы камеры:

Мембрана делит специальную камеру на два отсека.
В верхний отсек помещают взвесь исследуемых лейкоцитов.
В нижний отсек — раствор хемоаттрактанта (вещества, привлекающего клетки).
Размер пор мембраны подбирают так, чтобы лейкоциты могли пройти через них только в результате активного целенаправленного движения (миграции).

Подготовка суспензии полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ)

Смешивают равные объёмы гепаринизированной венозной крови и раствора Хенкса.
6–8 мл полученной смеси наслаивают на 3 мл градиента плотности фиколл-верографина.
Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 45 минут.
Удаляют слой плазмы, интерфазу и градиент до уровня 1–2 мм над осадком, содержащим эритроциты и ПЯЛ.
Для освобождения ПЯЛ от эритроцитов к осадку добавляют подогретый до 37 °C раствор полиглюкина (70 мл на 100 мл осадка).
Смесь выдерживают при 37 °C 60 минут в наклонном положении.
Образовавшийся надосадочный слой отсасывают в силиконированные центрифужные пробирки и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут.
Супернатант сливают, к осадку добавляют 0,81% раствор хлорида аммония на трис-NaCl-буфере для лизиса оставшихся эритроцитов.
Суспензию ресуспендируют, выдерживают 5 минут при комнатной температуре и снова центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут.
Осадок однократно отмывают раствором Хенкса (pH 7,2–7,4) в том же режиме.
Готовят рабочую суспензию в растворе Хенкса с добавлением 10% инактивированной эмбриональной сыворотки телят.

Контроль качества клеток:

В камере Горяева с окрашиванием 0,1% раствором трипанового синего определяют жизнеспособность клеток.
Рассчитывают количество клеток в 1 мл суспензии: число клеток в 5 больших квадратах по диагонали умножают на коэффициент 12,5 и на 10.
Готовую суспензию можно хранить не более 4 часов при комнатной температуре.
Для постановки реакции хемотаксиса концентрацию ПЯЛ доводят до 2 × 10⁶ клеток/мл.

Постановка реакции хемотаксиса

Нижние пять отсеков камеры Бойдена заполняют стандартным хемоаттрактантом.
Сверху накрывают предварительно смоченным в горячей дистиллированной воде мембранным фильтром, не оставляя пузырьков воздуха.
Собирают камеру и заполняют те же пять верхних отсеков подготовленной клеточной суспензией.
Параллельно ставят контроль: нижние отсеки другой камеры (или на том же фильтре) заполняют культуральной средой для клеток (раствор Хенкса с 10% инактивированной эмбриональной сыворотки телят).
Чтобы избежать испарения, камеру прикрывают стеклом и инкубируют при 37 °C в течение 1 часа.

Фиксация, окрашивание и учёт результатов

После инкубации жидкость из верхних отсеков отсасывают, фильтр извлекают.
Фильтр фиксируют 3 минуты в разведённом метаноле или 96% этаноле.
Промывают дистиллированной водой.
Окрашивают 1% раствором трипанового синего или по Романовскому — Гимзе.
Снова промывают дистиллированной водой и микроскопируют во влажном состоянии под покровным стеклом.

Количественная оценка:

Подсчитывают количество клеток в 10 полях зрения на нижней стороне фильтра:

О — в опыте (с хемоаттрактантом).
К — в контроле (со средой, спонтанная миграция).

Подсчёт ведут при увеличении микроскопа в 280 раз.

Расчёт хемотаксического индекса (ХИ):

ХИ = (О - К) / К × 100

Определение хемоаттрактантной активности сыворотки крови и секретов

В качестве индикаторных (стандартных) клеток используют смесь ПЯЛ периферической крови от 3–5 здоровых доноров, полученную по описанной выше методике. Нижние отсеки камеры заполняют исследуемой жидкостью (сывороткой, секретом), верхние — стандартной суспензией ПЯЛ. Дальнейшие шаги и учёт результатов проводят аналогично.

Факторы, влияющие на воспроизводимость метода Бойдена

Мембранные фильтры: Решающее значение имеет их качество и однородность. Для уменьшения разброса результатов всю серию опытов следует ставить на фильтрах из одной партии.
Концентрация клеток: Число мигрирующих клеток пропорционально их концентрации в исходной взвеси. Постоянство этой концентрации от опыта к опыту гарантирует ошибку метода не более 5%.

Альтернативный метод

Хемотаксис клеток крови также можно определять в агарозе (метод миграции в агарозном геле).

Современный контекст

Метод Бойдена, описанный в 1962 году, стал классическим для изучения хемотаксиса in vitro. Сегодня, наряду с его модификациями, широко используются более современные методы:

Трансвелл-системы (аналоги камеры Бойдена) с различными типами пористых мембран и покрытий.
Микрофлюидные устройства, позволяющие создавать точные и стабильные градиенты химических веществ и в реальном времени наблюдать за движением отдельных клеток.
Анализ миграции в реальном времени с помощью видеомикроскопии и автоматического трекинга клеток.

Понимание молекулярных механизмов хемотаксиса (роль рецепторов, G-белков, перестройки цитоскелета) значительно углубилось. Нарушения хемотаксиса лейкоцитов (например, при синдроме Чедиака — Хигаси или синдроме «ленивых» лейкоцитов) признаны важными причинами иммунодефицитных состояний. Исследования хемотаксиса лежат в основе разработки новых противовоспалительных и иммуномодулирующих препаратов.