Новая технология визуализации поможет изучить респираторно-синцитиальный вирус (RSV)
Большинство детей переносят респираторно-синцитиальный вирус (RSV) к двум годам с симптомами простуды. Однако для недоношенных детей и детей с хроническими заболеваниями RSV может привести к пневмонии и бронхиту, требующим госпитализации и имеющим долгосрочные последствия.
Новая методика изучения структуры вириона RSV и его активности в живых клетках может раскрыть секреты вируса: как он проникает в клетки, реплицируется, сколько геномов встраивает в хозяина и почему некоторые клетки лёгких остаются относительно незатронутыми. Это может дать информацию для разработки новых противовирусных препаратов и, возможно, вакцины для предотвращения тяжёлых инфекций RSV.
«Нам нужны инструменты, чтобы понять, как вирус действительно работает, — сказал Филип Сант Анджело, доцент кафедры биомедицинской инженерии Уоллеса Х. Коултера в Технологическом институте Джорджии и Университете Эмори. — Нам необходимо отслеживать инфекцию в отдельной живой клетке, не влияя на процесс заражения, и эта технология должна нам это позволить».
Исследование было поддержано Национальным институтом общих медицинских наук NIH и опубликовано онлайн в журнале ACS Nano 30 декабря 2013 года. Хотя первой мишенью является RSV, разработанная методика визуализации может быть использована для изучения других РНК-вирусов, включая грипп и Эболу.
«Мы показали, что можем метить геном с помощью наших зондов, — пояснил Сант Анджело. — Мы узнали, что геном действительно включается в вирион, и что созданные вирусные частицы инфекционны. Мы смогли охарактеризовать некоторые аспекты самой вирусной частицы с супер-разрешением, до 20 нанометров, используя микроскопию прямого стохастического оптического восстановления (dSTORM)».
RSV сложно изучать. Инфекционная частица может принимать разные формы: от 10-микронных филаментов до обычных сфер. Вирус может встраивать более одного генома в клетки-хозяева, а ориентация и структура РНК неупорядочены, что затрудняет характеристику.
Исследовательская группа, включавшая учёных из Университета Вандербильта и Университета Эмори, использовала технологию зондов, которые быстро присоединяются к РНК внутри клеток. Зонд использует несколько флуорофоров для индикации вирусной РНК, позволяя учёным видеть её перемещение в клетках-хозяевах и наблюдать, как инфекционные частицы покидают клетки для распространения инфекции.
«Возможность видеть геном и потомство РНК, происходящее от генома, с помощью наших зондов даёт гораздо больше информации о цикле репликации, — сказал Сант Анджело. — Это позволяет нам понять, что вирус действительно делает. Если мы сможем визуализировать проникновение, сборку и репликацию вируса, это позволит нам решить, на что нацелиться для борьбы с ним».
Исследование опиралось на новый метод мечения РНК-вирусов с использованием мультимеченных тетравалентных РНК-визуализирующих зондов (MTRIPS). Зонды состоят из химерной комбинации ДНК и РНК олигонуклеотидов, меченных внутри флуорофорами и тетравалентно связанных с нейтравидином. Химерная комбинация помогла зондам избежать клеточной защиты.
«В клетке много сенсоров, которые ищут чужеродные РНК и ДНК, но для клетки этот зонд ни на что не похож, — объяснил Сант Анджело. — Клетка не распознаёт нуклеиновую кислоту как чужеродную».
Введённые в клетки зонды быстро диффундируют через клетку, инфицированную RSV, и связываются с РНК вируса. Прочно связываясь, зонд не влияет на нормальную активность вируса и позволяет исследователям отслеживать её в течение нескольких дней с помощью стандартных методов микроскопии. MTRIPS могут дополнять другие технологии зондов, такие как GFP и золотые наночастицы.
Ключевой для проекта стала работа аспиранта Эрика Алонаса по концентрации вируса без снижения его инфекционности, что могло бы повлиять на способность проникать в клетки-хозяева.
Следующей задачей было изучение прогрессирования инфекции в отдельных клетках, которые двигаются. Лаборатория Томаса Баркера использовала микроструктурированный фибронектин на стекле для создания 50-микронных «островков», удерживающих клетки во время исследования.
Одна из загадок, которую учёные хотели бы решить, — почему одни клетки лёгких сильно инфицированы, а другие, кажется, избегают вредного воздействия.
«Если вы посмотрите на поле клеток, вы увидите огромные различия от клетки к клетке, и это совершенно не понятно, — сказал Сант Анджело. — Если мы сможем выяснить, почему одни клетки переполнены вирусом, а другие нет, возможно, мы найдём способ помочь плохим клеткам стать больше похожими на хорошие».
В команду также вошли Джеймс Кроу (Университет Вандербильта), Элизабет Райт (Университет Эмори), Дэрилл Вановер, Джина Джунг, Кьяра Зурла, Джонатан Киршман, Винсент Фиоре, Элисон Дуглас (Технологический институт Джорджии и Университет Эмори), Аарон Лифланд и Манаса Гудхети (Vutara Inc.), Хонг Йи (Университет Эмори).
Одна из проблем изучения RSV — сохранение его активности в лабораторных условиях, в отличие от естественной среды.
«Когда вы работаете с этим вирусом в лаборатории, вы всегда должны быть осторожны, чтобы он не потерял инфекционность, — отметил Сант Анджело. — Но если взять комнату, полную неинфицированных детей, и запустить туда одного заражённого ребёнка, через 15 минут все дети будут инфицированы».