Новый метод визуализации активности некультивируемых микробов

Исследователи разработали высокопроизводительный метод для одновременной идентификации и изучения активности некультивируемых микроорганизмов ("микробной темной материи") в их естественной среде.

Проблема изучения "микробной темной материи"

Многие некультивируемые микробы играют ключевые, но неизвестные роли в биогеохимических процессах Земли. Большинство существующих методов не позволяют одновременно идентифицировать эти микроорганизмы и определять их активность.

В исследовании, опубликованном 28 июня 2016 года в PNAS, ученые из Калифорнийского технологического института (Caltech) и Объединенного института генома Министерства энергетики США (DOE JGI) применили усовершенствованную технику для идентификации как отдельных активных клеток, так и кластеров активных бактерий и архей в микробных сообществах.

"Одна из самых больших проблем — определить, когда некультивируемые микробы метаболически активны и какова их экологическая функция", — отметил первый автор исследования Роланд Хатценпихлер.

Метод BONCAT: маркировка активных клеток

Исследователи адаптировали для микробной экологии метод BONCAT (BioOrthogonal Non-Canonical Amino acid Tagging), первоначально разработанный в Caltech для биоинженерии.

Принцип работы:

• BONCAT использует синтетические аминокислоты для маркировки клеток, синтезирующих белки (т.е. активных).
• Эти аминокислоты затем окрашиваются флуоресцентным маркером, что позволяет "подсветить" активные клетки в их естественной среде обитания.

В данном исследовании ученые использовали образцы глубоководных осадков с метановых сипов у побережья Орегона и Калифорнии. Сообщества в этих осадках включают агрегаты архей, окисляющих метан (ANME — ANaerobic MEthanotrophs), и сульфатредуцирующих бактерий (SRB), которые живут симбиотически и отвечают за удаление около 80% метана, выделяемого из морских осадков.

Комбинируя BONCAT с флуоресцентной in situ гибридизацией (FISH), исследователи смогли проанализировать активных микробов в смоделированных условиях и определить, при каких условиях они активны. Было обнаружено, что в инкубации были анаболически активны представители всех групп архей, окисляющих метан.

BONCAT-FACS: сортировка и геномный анализ активных агрегатов

Ученые DOE JGI помогли адаптировать метод BONCAT для проточной цитометрии, создав технику BONCAT-FACS (BONCAT — Fluorescence-Activated Cell Sorting).

Процесс:

1. Активные клетки или их агрегаты маркируются с помощью BONCAT.
2. Клеточный сортер (FACS) выделяет эти активные агрегаты.
3. На отдельных агрегатах проводится полногеномная амплификация.
4. Секвенируются гены 16S рРНК для идентификации клеток в агрегате.
5. Планируется полногеномное секвенирование этих образцов.

Ключевое открытие: неожиданные симбиотические связи

С помощью BONCAT-FACS команда обнаружила, что археи, окисляющие метан, взаимодействуют не только с известными сульфатредуцирующими бактериями, но и с представителями малоизученного типа Verrucomicrobia. Эти взаимодействия ранее не наблюдались, что указывает на более широкий спектр симбиотических отношений у архей, окисляющих метан. Вопрос о взаимовыгодности этих связей сейчас изучается.

"Объединив усилия, мы смогли изолировать отдельные клеточные кластеры, участвующие в разложении парникового газа метана, идентифицировать клеточных партнеров в этом процессе и получить представление об их генетическом коде", — сказал Хатценпихлер.

Геномная информация, полученная от пар архей и бактерий, будет использована для более глубокого понимания физиологии, механизмов взаимодействия и энергетического обмена между различными метанотрофными консорциумами в окружающей среде.