Исследователи разработали универсальную и недорогую технологию для целевого длинночтения РНК-секвенирования
Исследователи из Детской больницы Филадельфии (CHOP) разработали универсальную и недорогую технологию для целевого секвенирования полноразмерных молекул РНК. Технология, названная TEQUILA-seq, является высокоэффективной по стоимости по сравнению с коммерческими решениями для целевого РНК-секвенирования и может быть адаптирована для различных исследовательских и клинических целей. Подробности описаны в статье в Nature Communications.
Альтернативный сплайсинг позволяет одному гену кодировать несколько разных белков. Его нарушение при таких заболеваниях, как рак, может приводить к образованию патогенных молекул РНК. Для понимания этого процесса необходимо точное определение всех молекул РНК (изоформ транскриптов), производимых одним геном.
Платформы "длинного чтения" (long-read) секвенируют молекулы РНК длиной более 10 000 оснований от начала до конца, захватывая полную изоформу транскрипта. Однако у них скромная производительность, что затрудняет их широкое внедрение, особенно в клинической практике, из-за высокой стоимости получения данных достаточной глубины. Целевое секвенирование, которое включает обогащение специфических нуклеиновых кислот до секвенирования, может существенно повысить покрытие целевых участков, но стоимость и сложность захвата мишеней были барьерами для широкого использования.
"Существующие технологии для целевого секвенирования полноразмерных молекул РНК либо дороги, либо сложны в настройке", — сказал соавтор Лан Линь, Ph.D. — "TEQUILA-seq решает эту проблему, будучи одновременно недорогой и простой в использовании".
Один из методов целевого секвенирования — обогащение на основе гибридизационного захвата — использует короткие нуклеиновые кислоты (олигонуклеотиды) в качестве зондов захвата. Эти олигонуклеотиды помечены молекулами биотина и гибридизуются с мишенями на основе комплементарности последовательностей. Однако коммерчески синтезированные биотинилированные зонды захвата дороги и могут быть использованы для ограниченного числа реакций, что делает стоимость на образец высокой.
Чтобы решить эту проблему, исследователи CHOP разработали TEQUILA-seq (Transcript Enrichment and Quantification Utilizing Isothermally Linear-Amplified probes). Ключевая инновация — реакция изотермической амплификации со смещением цепи, запускаемая никинг-эндонуклеазой. Она позволяет синтезировать большое количество биотинилированных зондов захвата из дешёвого пула небиотинилированных олигонуклеотидов в качестве матриц.
Используя всего 2 нг матричных олигонов, исследователи могут получить 25 мкг зондов TEQUILA, которых хватит как минимум на 250 реакций захвата. Эта стратегия делает TEQUILA-seq высокоэффективным по стоимости и масштабируемым для больших панелей мишеней и множества биологических образцов.
При тестировании на синтетических и человеческих РНК зонды TEQUILA показали такую же эффективность в захвате и обогащении мишеней, как и коммерческие зонды, будучи при этом в сотни раз дешевле на одну реакцию захвата. TEQUILA-seq значительно усиливает детекцию, сохраняя при этом количественную оценку целевых молекул РНК.
"TEQUILA-seq позволяет нам глубоко секвенировать полноразмерные молекулы РНК для любого набора генов во многих биологических образцах", — сказал соавтор И Син, Ph.D.
Чтобы продемонстрировать биомедицинскую пользу, исследователи применили TEQUILA-seq для профилирования полноразмерных молекул РНК 468 значимых раковых генов в 40 линиях клеток рака молочной железы. Они обнаружили ранее неизвестные изоформы транскриптов в хорошо изученных раковых генах, что может пролить свет на то, как гены, защищающие организм от рака, инактивируются в отдельных опухолях.
"Наша работа показывает, что TEQUILA-seq может широко использоваться для целевого секвенирования полноразмерных молекул РНК", — сказал доктор Линь. — "Более того, зонды TEQUILA являются универсальными зондами захвата. Они совместимы как для целевого РНК-, так и ДНК-секвенирования, на платформах как длинного, так и короткого чтения".