Исследование раскрывает структуры шести состояний роторного натриевого насоса

Шесть структур, демонстрируемых вращающимся натриевым насосом, были реконструированы в 3D с помощью криоэлектронной микроскопии. Анализ показал, что ротор демонстрирует неравномерное вращение из-за частичного структурного взаимодействия со статором, и взаимодействует с одним краем большого кольца транспорта ионов, заставляя его вращаться. Исследование показало уникальный молекулярный механизм роторного натриевого насоса.

Результаты опубликованы в Communications Biology.

"В предыдущих экспериментах по визуализации одиночных молекул предсказывалось, что три основные точки паузы ротора будут находиться на расстоянии 120 градусов друг от друга, а каждая суб-пауза — на 40 градусов впереди (80 градусов назад) от каждой основной паузы, но структурных доказательств не было... Также было загадкой, как тонкий вал (ротор), соединяющий силовой блок, вращает кольцо транспорта ионов натрия, которое больше этого блока. Ротор вращает большое кольцо транспорта ионов, как будто размешивает его, с неравномерным вращением", — сказал автор-корреспондент Кадзуёси Мурата.

Фон: EhV-ATPase

Почти все живые организмы, от бактерий до человека, имеют в своих клеточных мембранах роторный фермент ATP-синтазу. У всех них схожая структура, в которой внемембранная часть для разложения или синтеза соединения ATP и внутримембранная часть для прохождения ионов через мембрану соединены тонким валом (ротором), обеспечивая двойную функциональность.

Роторный натриевый насос (Enterococcus hirae V-ATPase, EhV-ATPase) разлагает ATP во внемембранном силовом блоке (V1) и вращает ротор в его центре, который, в свою очередь, вращает кольцо транспорта ионов натрия (c-кольцо) внутримембранного насосного блока (Vo). Это переносит ионы натрия изнутри клетки наружу.

Силовой блок состоит из трёх симметрично расположенных доменов разложения ATP (состоящих из A/B гетеродимера), которые, как известно, вращают ротор на 120 градусов за счёт последовательного разложения ATP. Ранее группа пометила этот силовой блок наночастицей золота и провела эксперименты по визуализации одиночных молекул, обнаружив суб-паузы (State 1'–3') в каждой позиции на 40 градусов впереди (80 градусов назад) от основных пауз (State 1–3), и идентифицировав шесть состояний "паузы".

Результаты исследования

Чтобы ответить на вопросы о структуре, команда индуцировала вращение, добавив ATP и ионы натрия к солюбилизированному детергентом EhV-ATPase, быстро заморозила образец и собрала множество изображений с помощью криоэлектронной микроскопии. После классификации изображений и их 3D-реконструкции им впервые удалось реконструировать в общей сложности 6 структур, состоящих из 3 основных пауз и 3 суб-пауз.

  • Отклонения угла вращения: Вращение ротора должно было останавливаться в основных точках паузы (States 1–3), разделённых на 120°. Это подтвердилось для States 1 и 2, но в State 3 было обнаружено отклонение угла ротора на -10°. На суб-паузах (State 1'–3') наблюдались большие отклонения угла: +13° (State 1'), +32° (State 2') и +28° (State 3') от ожидаемых значений.
  • Механизм вращения c-кольца: Было обнаружено, что край ротора отклоняется от центра c-кольца и взаимодействует с одним его краем, заставляя c-кольцо вращаться, как при размешивании. Это отклонение угла вращения особенно выражено между States 2 и 3, и считается, что оно вызвано структурным взаимодействием между субъединицей "d" на краю ротора и соседней статорной субъединицей "a".
  • Состояния ATP в силовом блоке: В силовом блоке V1 удалось частично подтвердить изменения в состояниях связывания и разложения ATP во время вращательного движения. На основе предыдущих исследований считается, что три симметрично расположенных ATP-связывающих домена последовательно демонстрируют три состояния: "Closed" (связан ATP), "Semi-closed" (ATP разложен на ADP и фосфат, Pi) и "Open" (ATP или ADP не связаны).
    • В трёх основных паузах была подтверждена конформация ATP-связывающей структуры.
    • В трёх суб-паузах, за исключением State 2', были получены структуры, которые считаются состоянием, в котором все ATP-связывающие карманы заполнены ATP или ADP до высвобождения ADP и перехода домена в состояние "Open".
    • В State 2' структурное взаимодействие ротора со статором, как полагают, заставляет ATP-связывающий домен перейти в то же состояние, что и в State 3, и остановиться.

Значение результатов и перспективы

В этом исследовании, активно индуцируя вращение и анализируя структуры во время него, учёные визуализировали шесть структур EhV-ATPase. Этот результат прояснил, что EhV-ATPase транспортирует ионы натрия, вращая большое c-кольцо, и показал, что структурное взаимодействие ротора с частью статора вызывает отклонение угла вращения.

Эти открытия предполагают адаптивный процесс эволюции от простых к более сложным структурам у почти повсеместно распространённых роторных ионных насосов и предоставили много структурной информации для разработки ингибиторов и функциональной модификации ферментов. Ожидается, что на основе этого результата значительно продвинутся разработка лекарств, нацеленных на этот ионный насос.