Устранение неопределенности в генной инженерии: конвейер STAMPScreen помогает оптимизировать генетические исследования в клетках млекопитающих
Ученые из Института Висса, Гарвардской медицинской школы (HMS) и Медиа-лаборатории MIT создали интегрированный конвейер для проведения генетического скрининга, охватывающий все этапы — от идентификации целевых генов до их клонирования и эффективного скрининга.
Протокол, названный Sequencing-based Target Ascertainment and Modular Perturbation Screening (STAMPScreen), описан в Cell Reports Methods, а связанные с ним алгоритмы с открытым исходным кодом доступны на GitHub.
"STAMPScreen — это оптимизированный рабочий процесс, который позволяет исследователям легко идентифицировать гены, представляющие интерес, и проводить генетический скрининг, не гадая, какой инструмент использовать", — сказал автор-корреспондент Пранам Чаттерджи.
От идеи до реализации
Исследователи столкнулись с проблемами существующих методов: алгоритмы не указывали причину изменения экспрессии гена, инструменты для вставки генов в клетки были дорогими, медленными и негибкими. Например, клонирование 50 генов методами Golden Gate и Gateway занимало месяцы и тысячи долларов.
Команда создала STAMPScreen, чтобы решить эти проблемы для широкого спектра проектов — от белковой инженерии до исследований фертильности и старения.
Вычислительный этап: от данных к генам-мишеням
Для улучшения ранней стадии исследований созданы два новых алгоритма, работающих с данными секвенирования нового поколения (NGS):
- Первый алгоритм объединяет данные об уровне экспрессии гена, состоянии клетки и известных белковых взаимодействиях. Высокий балл получают гены, тесно связанные с другими и чья активность коррелирует с крупными изменениями на уровне клетки.
- Второй алгоритм генерирует сети, отображающие динамические изменения экспрессии генов во время дифференцировки клеток, и применяет меры центральности (например, алгоритм PageRank от Google) для ранжирования ключевых регуляторов процесса.
"Большинство алгоритмов могут сказать вам, какие гены находятся в одном ряду, но наши позволяют определить, насколько высоко или низко они находятся в «башне», чтобы быстро идентифицировать те, которые оказывают наибольшее влияние", — пояснил Чаттерджи.
Экспериментальный этап: инструменты для редактирования
После идентификации целевых генов протокол переходит в лабораторию. Команда провела прямое сравнение нескольких инструментов генетических пертурбаций, включая кДНК (cDNA) и несколько версий CRISPR, в человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (hiPSC).
Они создали новый инструмент, позволяющий использовать CRISPR и cDNA в одной и той же клетке, что раскрывает синергию методов. Например, CRISPR может выключить экспрессию всех изоформ гена, а cDNA — последовательно экспрессировать каждую изоформу индивидуально.
Клонирование и скрининг: метод MegaGate
Для создания библиотек скрининга исследователи разработали новый метод клонирования — MegaGate. Он заменяет токсичную систему отбора в методе Gateway на сайты узнавания ферментов мегануклеаз.
- Плазмиды, успешно получившие ген-мишень, теряют эти сайты и становятся нечувствительными к мегануклеазе.
- Плазмиды без гена-мишени сохраняют сайты и разрушаются при добавлении фермента.
Этот метод решает проблему добавления штрих-кодов (barcode) к векторам для их идентификации. Успешность клонирования составила 99.8%, метод совместим с существующими библиотеками генов (например, TFome, hORFeome).
"Мы клонировали почти 1500 генов с его помощью, и у нас еще не было ни одного сбоя", — сказал соавтор Александру Плеша.
Анализ результатов
Исследователи продемонстрировали успешную вставку векторов со штрих-кодами в живые hiPSC. Анализ пулов клеток с помощью NGS позволяет определить, какие доставленные гены экспрессируются. Для считывания как генетических штрих-кодов, так и полных транскриптомов можно использовать различные методы: RNA-Seq, TAR-Seq и Barcode-Seq.
Перспективы и модульность
STAMPScreen может быть полезен для широкого спектра исследований:
- Изучение путей и сетей регуляции генов
- Скрининг факторов дифференцировки
- Характеризация лекарств и сложных путей
- Моделирование мутаций
Платформа является модульной, что позволяет ученым интегрировать ее отдельные части в свои рабочие процессы.
"STAMPScreen поможет исследователям быстрее достигать «моментов озарения» и ускорит темп инноваций в генной инженерии", — сказал старший автор Джордж Чёрч.