Упрощение технологии Perturb-seq для широкого использования
Исследователи из Принстонского университета, Калифорнийского университета в Сан-Франциско и компании 10X Genomics представили усовершенствования метода Perturb-seq, которые делают масштабные исследования генной регуляции более доступными. Работа опубликована 30 марта в журнале Nature Biotechnology.
Суть метода Perturb-seq
Метод состоит из двух ключевых шагов:
- Направленное воздействие на гены с помощью технологий на основе CRISPR (CRISPRi/CRISPRa).
- Анализ последствий с помощью секвенирования РНК единичных клеток (scRNA-seq), которое показывает, как изменилась экспрессия всех генов в клетке после воздействия.
Главной технической проблемой было отсутствие прямого захвата синтетических направляющих РНК (sgRNA), которые используются в CRISPR для нацеливания на конкретные гены. Без этого исследователям приходилось применять косвенные методы, особенно сложные при доставке нескольких sgRNA в одну клетку.
Ключевые улучшения
Исследователи во главе с Джозефом М. Реплоглом разработали новые протоколы — direct capture Perturb-seq.
- Прямой захват sgRNA: Протоколы позволяют захватывать и амплифицировать последовательности sgRNA одновременно с транскриптомом клетки в ходе scRNA-seq.
- Отслеживание комбинаций: Это упрощает отслеживание присутствия нескольких sgRNA в отдельных клетках, что также повышает эффективность CRISPRi.
- Обогащение целевых мРНК: Команда также разработала способ обогащения мРНК конкретных генов интереса из транскриптомов scRNA-seq, что делает эксперименты значительно дешевле.
Практическая демонстрация
Ученые использовали direct capture Perturb-seq, чтобы повторить и расширить результаты более раннего исследования. Они подтвердили, что подавление генов, вовлеченных в биосинтез холестерина, приводит к накоплению токсичного метаболического промежуточного продукта, повреждающего ДНК клетки. Новый метод позволил быстро охарактеризовать клеточный ответ, смоделировать, как клетки справляются с этим промежуточным продуктом, и выяснить последствия сбоя этого механизма.
«Вместе эти улучшения должны помочь исследователям расширить масштаб экспериментов Perturb-seq и лучше изучить, как работают гены», — сказала руководитель исследования Бритт Адамсон.