Мощная стратегия создания микробных клеточных фабрик с использованием синтетических малых РНК

Производство химикатов, топлива и материалов в значительной степени зависит от ископаемых ресурсов. Однако из-за растущей озабоченности по поводу изменения климата и других экологических проблем наблюдается большой интерес к созданию биорефайнингов для производства такой продукции из возобновляемых ресурсов. Для конкурентоспособности биорефайнингов с традиционными, основанными на ископаемых ресурсах, ключевое значение имеет разработка высокопроизводительных микроорганизмов, так как это наиболее значительно влияет на экономику процесса. Метаболическая инженерия, целенаправленная модификация клеточных метаболических и регуляторных сетей для улучшения производства целевого продукта, успешно применяется для повышения эффективности клеток. Однако инженерия клеточного метаболизма и регуляторных цепей нетривиальна из-за их высокой сложности.

В метаболической инженерии важно находить гены, которые необходимо усилить или ослабить, чтобы увеличить скорость образования продукта, минимизируя производство нежелательных побочных продуктов. Часто проводят эксперименты по нокауту генов для удаления метаболических потоков, ведущих к увеличению целевого продукта. Однако такие эксперименты требуют много усилий и времени, их сложно проводить для большого числа генов. Более того, результаты нокаута, полученные для одного штамма, нельзя перенести на другой организм, и весь процесс приходится повторять. Это большая проблема при создании высокопроизводительной микробной клеточной фабрики, так как требуется найти лучший штамм-платформу среди множества. Поэтому исследователи стремились разработать стратегию, позволяющую быстро идентифицировать множественные гены для ослабления в нескольких штаммах одновременно.

Корейская исследовательская группа под руководством заслуженного профессора Санг Юп Ли из Департамента химической и биомолекулярной инженерии Корейского института передовых наук и технологий (KAIST) сообщила о разработке стратегии эффективного создания микробных клеточных фабрик с использованием синтетических малых РНК (sRNA). Впервые они сообщили о разработке такой системы в Nature Biotechnology в феврале. Эта стратегия использования синтетических sRNA в метаболической инженерии вызывает большой интерес во всем мире, поскольку позволяет легко, быстро, в высокопроизводительном режиме, настраиваемо и обратимо "нокаутировать" (подавлять экспрессию) несколько генов в нескольких штаммах одновременно. Теперь статья, опубликованная онлайн 8 августа в качестве обложки сентябрьского выпуска Nature Protocols, описывает подробную стратегию и протокол использования синтетических sRNA для метаболической инженерии.

В статье команда описывает подробный пошаговый протокол контроля экспрессии генов на основе синтетических sRNA, включая принципы их дизайна. Синтетические sRNA, созданные на заказ, можно легко манипулировать с помощью обычного метода клонирования генов. Использование синтетических sRNA для регуляции экспрессии генов дает несколько преимуществ, таких как портативность, условность и настраиваемость в высокопроизводительных экспериментах. Плазмидная система экспрессии синтетических sRNA не оставляет следов на хромосоме и может быть легко перенесена во многие другие исследуемые штаммы-хозяева. Таким образом, создание библиотек и исследование разных штаммов-хозяев намного проще, чем с использованием традиционных систем жесткого кодирования генов. Кроме того, экспрессию генов можно условно подавлять, контролируя производство синтетических sRNA. Синтетические sRNA с разной эффективностью репрессии позволяют точно настраивать уровни экспрессии генов. Более того, синтетические sRNA позволяют подавлять экспрессию жизненно важных генов, что было невозможно в экспериментах с традиционным нокаутом генов.

Синтетические sRNA можно использовать для различных экспериментов, где требуется регуляция экспрессии генов. Одно из перспективных применений — высокопроизводительный скрининг целевых генов для манипуляций и нескольких штаммов одновременно для повышения производства целевых химикатов и материалов. Такая одновременная оптимизация генов-мишеней и штаммов была одной из больших проблем в метаболической инженерии. Другое применение — точная настройка экспрессии отобранных генов для оптимизации потоков, что может дополнительно повысить производство химикатов за счет балансировки потока между образованием биомассы и производством целевого химического вещества. Синтетические sRNA также можно применять для точной регуляции генетических взаимодействий в цепи или сети, что важно в синтетической биологии. После создания плазмиды, содержащей каркас sRNA, синтетические sRNA на заказ можно получить за 3–4 дня, после чего провести необходимые прикладные эксперименты.

Доктор Эйтан Злоторински, редактор Nature Protocols, сказал: "Эта статья описывает подробный протокол для дизайна и применения синтетических sRNA. Этот метод, имеющий много преимуществ, вероятно, станет общепринятой практикой и окажется полезным для исследований в области метаболической инженерии и синтетической биологии".