Новый "золотой стандарт" контроля качества для РНК-секвенирования единичных клеток

Исследователи из Каролинского института представили новый инструмент контроля качества "золотого стандарта" для подсчёта молекул mRNA при секвенировании единичных клеток. Метод описан в журнале Nature Methods.

Профессор Рикард Сандберг и его коллеги вводят понятие "молекулярных спайков" — синтетической РНК, которую можно добавлять в препараты библиотек из единичных клеток. Эти спайки содержат встроенные метки для различения отдельных молекул ("Уникальные молекулярные идентификаторы" или UMIs). Впервые такой контроль предоставляет эталонную "истину" для проверки как экспериментальных, так и вычислительных методов подсчёта молекул в единичных клетках.

"Мы используем эти спайки, чтобы подтвердить, что широко применяемые методы точно подсчитывают молекулы РНК. Одновременно мы показываем, что другой недавно опубликованный метод страдает от серьёзного завышения подсчёта из-за проблемы во время ПЦР", — говорит Рикард Сандберг.

Улучшенный контроль экспериментов

Стратегии подсчёта молекул РНК повсеместно используются в экспериментах с единичными клетками. Однако точность этих подходов было сложно оценить количественно. "Используя молекулярные спайки, учёные теперь могут контролировать свои эксперименты и вычислительные подходы, подтверждая их точность. Мы также предлагаем решение для 'спасения' проблемных экспериментов".

Спайки были получены in vitro транскрипцией РНК из плазмид, кодирующих экзогенные последовательности. В эти плазмиды клонировали серию высокоразнообразных вставок, содержащих дополнительные штрих-коды и последовательности UMI. Полученную библиотеку спайк-РНК, кодирующую 264 транскрипта, соответствующих более чем 75 миллионам уникальных UMI, исчерпывающе секвенировали для количественной оценки относительной представленности всех последовательностей.

Затем эти молекулярные спайки использовали в серии экспериментов по транскриптомике единичных клеток, чтобы тщательно проверить способности к подсчёту в разных методах и улучшить способы нормализации данных на их основе.

Доступность для других исследователей

"Мы предоставим молекулярные спайк-РНК бесплатно любой академической лаборатории, которая заинтересована. Их использование может выявить экспериментальные ошибки и помочь улучшить воспроизводимость в сложных экспериментах с единичными клетками. Особенно в разработке методов для единичных клеток использование молекулярных спайков критически важно, поскольку метрики, обычно используемые в такой разработке, фактически поощряют экспериментальные ошибки, ведущие к завышению подсчёта".