Ученые создали системы предсказуемых мультинуклеотидных делеций в растениях

Многие небольшие регуляторные элементы, такие как miRNA, сайты связывания miRNA и цис-действующие элементы, состоят всего из 5–24 нуклеотидов. Они играют важную роль в регуляции экспрессии генов, транскрипции и трансляции, а также структуры белков, что делает их перспективными мишенями для изучения функции генов и улучшения сельскохозяйственных культур.

Система CRISPR-Cas9 широко применяется в геномной инженерии. В ней нуклеаза Cas9, направляемая sgRNA, создает двухцепочечные разрывы (DSBs) в хромосомах. Эти разрывы в основном восстанавливаются путем негомологичного соединения концов (NHEJ), что часто приводит к коротким вставкам или делециям (инделам) размером 1–3 п.н. Однако неоднородность этих небольших инделов затрудняет целенаправленное разрушение регуляторных ДНК. Поэтому создание точной и предсказуемой системы мультинуклеотидных делеций имеет большое значение для анализа функции генов и применения этих регуляторных ДНК.

Исследовательская группа под руководством профессора Гао Цайся из Института генетики и биологии развития Китайской академии наук (CAS) сосредоточилась на разработке новых технологий для эффективного и специфического редактирования генома. Основываясь на механизме дезаминирования цитидина и эксцизионной репарации оснований (BER), исследователи создали серию систем делеций, индуцированных слиянием APOBEC-Cas9 (AFID). Эти системы объединяют Cas9 с человеческой APOBEC3A (A3A), урацил-ДНК-гликозилазой (UDG) и AP-лиазой и успешно индуцировали точные, предсказуемые мультинуклеотидные делеции в геномах риса и пшеницы.

«AFID-3 производила различные предсказуемые делеции, простирающиеся от 5′-дезаминированных цитозинов до сайтов разреза Cas9, со средней предсказанной долей более 30%», — сказал профессор Гао.

Исследователи также проанализировали активность дезаминирования различных цитозиндезаминаз в протопластах риса и обнаружили, что укороченная APOBEC3B (A3Bctd) демонстрирует не только более высокую эффективность редактирования оснований, но и более узкое окно активности по сравнению с другими дезаминазами.

Поэтому они заменили A3A в AFID-3 на A3Bctd, создав eAFID-3. Эта система производит более однородные делеции от предпочтительных TC-мотивов до двухцепочечных разрывов, с эффективностью в 1,52 раза выше, чем у AFID-3.

Кроме того, исследователи использовали систему AFID для нацеливания на эффектор-связывающий элемент гена OsSWEET14 у риса и обнаружили, что мутанты с предсказуемой делецией обладают повышенной устойчивостью к бактериальному ожогу риса.

Системы AFID превосходят другие современные инструменты для создания предсказуемых мультинуклеотидных делеций в пределах протоспейсера и, таким образом, обещают стать надежным инструментом для фундаментальных исследований и генетического улучшения.

Научная статья команды под названием «Precise, predictable multi-nucleotide deletions in rice and wheat using APOBEC–Cas9» была опубликована в журнале Nature Biotechnology.