Новый инструмент для эффективной проверки точности реакций CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas9 — это исключительный инструмент для редактирования генома, но технология не идеальна. При использовании она иногда производит вставки и делеции (indels) в непредусмотренных сайтах вне мишени (off-target). Поскольку нецелевое расщепление гена может привести к неожиданной мутации, критически важно обнаруживать любые ошибки в процессе CRISPR-Cas9.
Группа ученых из Центра геномной инженерии Института фундаментальных наук (IBS) представила в журнале Genome Research инструмент, названный мультиплексным Digenome-seq (секвенирование переваренного генома).
Как работает Digenome-seq
- Метод отличается от других клеточных методов тем, что он детектирует расщепления ДНК in vitro, а не в клетках, используя бесклеточную геномную ДНК.
- Преимущество использования бесклеточной ДНК — более точные результаты анализа, поскольку хроматин, присутствующий в клетке, не мешает процессу.
- Метод проще, быстрее и дешевле, так как исследуемую ДНК не нужно предварительно амплифицировать в больших количествах с помощью ПЦР.
Процесс и оценка точности
- Бесклеточная ДНК-мишень комбинируется in vitro с белком Cas9 и sgRNA (однонаправляющая РНК).
- sgRNA направляет Cas9 к целевому и нецелевым сайтам на ДНК, где происходит расщепление эндонуклеазой Cas9.
- В исследовании ученые идентифицировали сайты расщепления in vitro и измерили частоты indels в сотнях off-target сайтов в клетках.
- Точность оценивается с помощью системы OTI (индекс эффекта вне мишени), которая сравнивает соотношение частот off-target и on-target.
Преимущества мультиплексного подхода
В отличие от ранее использовавшихся моноплексных процессов, работающих с одной sgRNA за раз, мультиплексный Digenome-seq выполняет одновременный анализ множества sgRNA. Этот процесс:
- Быстрее, эффективнее и экономичнее.
- Способен обнаружить больше off-target indels, чем другие методы (например, HTGTS или Guide-seq).
Значение для будущего
Директор IBS Джин-Су Ким отметил, что CRISPR-Cas9 — невероятный научный прорыв, и эта техника может использоваться для выбора сайтов-мишеней с наименьшими побочными эффектами, что необходимо для терапевтического применения CRISPR-Cas9. Благодаря превосходной точности, экономии средств и скорости, мультиплексный Digenome-Seq выглядит новым стандартом для тестирования специфичности CRISPR-Cas9.