Состояние исследований CRISPR
CRISPR считается одной из самых перспективных технологий редактирования генов, способной произвести революцию в прецизионной медицине и искоренить генетические заболевания. Однако метод не идеален и требует улучшений. Новая работа совершенствует эту систему, создав новый белок-гибрид Cas9: ExoCas9. Этот гибрид обеспечивает более высокий общий уровень редактирования гена и смещает спектр повреждений ДНК в сторону значительно более длинных делеций.
Генетические заболевания преследуют человечество на протяжении всей его истории. Эти болезни возникают из-за мутаций в геноме человека. Изменения в геноме могут быть унаследованными или приобретёнными. К распространённым генетическим заболеваниям относятся серповидноклеточная анемия, болезнь Хантингтона, синдром Дауна, а также предрасположенность к диабету и даже раку. Но что, если учёные смогут исправить эти мутации в геноме человека до того, как они проявятся? Одно из самых актуальных направлений в биологии — использование системы CRISPR-Cas9 для редактирования ДНК. CRISPR впервые был использован для модификации ДНК в 2012 году, и с тех пор число публикаций об этой технологии резко возросло, достигнув пика в 2017 году — более 3000 статей.
Как редактируют ДНК?
ДНК состоит из четырёх оснований — нуклеотидов (A, C, T, G). Для модификации ДНК учёные часто создают сайт-специфичные двуцепочечные разрывы (DSBs) в определённых местах. Такие разрывы традиционно создавались с помощью цинковых пальцев (ZFNs) и нуклеаз TALEN (TALENs). После возникновения DSB клетка запускает два конкурирующих механизма репарации: преобладающее негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичную рекомбинацию (HR). Клетки чаще используют NHEJ, так как для него не нужна матрица ДНК. Однако механизм репарации NHEJ часто допускает ошибки, что приводит к вставкам или делециям нуклеотидов, из-за чего гены перестают нормально функционировать.
Однако и ZFNs, и TALENs громоздки и дороги в разработке, так как требуют димеризации для разрезания ДНК. Механизм эндонуклеазы CRISPR-Cas предлагает более простую альтернативу, удобную для дизайна и масштабных исследований.
Как работает CRISPR?
Механизм CRISPR-Cas9 был первоначально обнаружен у бактерий и архей как часть адаптивной иммунной системы. Система II типа CRISPR-Cas9 из S. pyogenes была адаптирована для редактирования ДНК в живых организмах благодаря своей простоте. Она состоит из двух компонентов: белка Cas9, который действует как "ножницы", разрезая ДНК, и sgRNA (single guide RNA), который распознаёт специфические последовательности ДНК, указывая Cas9 место для разреза.
Как можно улучшить CRISPR?
Редактирование генома с помощью Cas9 обычно приводит к небольшим вставкам или делециям, в среднем <10 нуклеотидов. Поскольку масштаб этих изменений мал, они не всегда гарантированно "выключают" функцию гена. Для решения этой проблемы учёным приходится очень тщательно выбирать сайты-мишени. Технологии, позволяющие создавать делеции длиной в десятки или сотни пар оснований, были бы очень полезны и дали бы больше свободы в выборе мишеней.
В нашей лаборатории мы стремились повысить эффективность редактирования генов на основе CRISPR-Cas9 у рыбок данио. Недавние исследования показали, что 3'-конец нетаргетной цепи ДНК высвобождается из комплекса Cas9 до его полной диссоциации. Мы предположили, что эту свободную цепь можно дополнительно модифицировать. Для этого мы создали гибридный белок, присоединив к Cas9 3'-5' экзонуклеазу Exo1 из E. coli, которая действует как "ластик". Новый гибрид был назван ExoCas9. Мы предположили, что ExoCas9 не только разрезает ДНК, но и "стирает" её часть, создавая более крупные делеции.
Мы подтвердили эту гипотезу, нацелившись на 3 разных гена в 9 различных сайтах-мишенях у рыбок данио. Во-первых, было показано, что ExoCas9 не наносит большего вреда эмбрионам по сравнению с обычным Cas9. Во-вторых, ExoCas9 обеспечивает статистически значимо более высокий уровень редактирования гена для 8 из 9 протестированных sgRNA. Наконец, ExoCas9 создаёт в среднем более крупные делеции для каждого тестируемого гена. Самая большая делеция, наблюдаемая с Cas9, составила 33 нуклеотида, а с ExoCas9 — 439 нуклеотидов! Интересно, что все делеции >40 нуклеотидов также имели направленное смещение, что открывает дополнительные возможности для применения ExoCas9.
Небольшие вставки или делеции в ДНК, кратные 3, часто не "выключают" функцию гена, так как являются in-frame мутациями. Однако даже если делеции, индуцированные ExoCas9, происходят группами по 3, они помогут учёным инактивировать ген с первой попытки, поскольку ExoCas9 создаёт в среднем более крупные делеции. Мы ожидаем, что этот вариант также позволит мутировать более широкий спектр геномных мишеней, недоступных для традиционного Cas9, у рыбок данио, других модельных организмов и даже у людей.
Выводы
Система CRISPR-Cas9 обладает огромным потенциалом для лечения многочисленных генетических заболеваний в течение нашей жизни. Генная терапия на основе редактирования генов уже вылечила редкое кожное заболевание — буллёзный эпидермолиз (БЭ) — у мальчика. Тем не менее, учёные в целом всё ещё совершенствуют этот относительно новый метод, и ExoCas9 — не первый опубликованный гибрид Cas9. Например, исследователи использовали гибрид Cas9 с нуклеазным доменом I-TevI (TevCas9), чтобы создавать два несовместимых разрыва в ДНК, что стабильно приводит к делециям длиной 33-36 нуклеотидов. Именно благодаря небольшим инновациям, подобным ExoCas9, в не столь отдалённом будущем использование редактирования генов для лечения генетических заболеваний станет обычным делом.