Использование растений для «выключения» генов насекомых с высокой производительностью

Учёные из Института химической экологии Макса Планка (Германия) применяют метод, ускоряющий экологические исследования насекомых: они изучают функции генов у гусениц бабочек, манипулируя генами с помощью технологии РНК-интерференции (RNAi). RNAi индуцируется путём скармливания личинкам растений, обработанных вирусными векторами. Этот метод, называемый «системой производства двуцепочечной РНК на основе растительного вируса», увеличивает пропускную способность образцов по сравнению с использованием генетически трансформированных растений.

Естественные токсины против травоядных

Более 200 000 видов насекомых являются травоядными. Они зависят от растений в питании и в ходе эволюции адаптировали свой метаболизм, чтобы нейтрализовать защиту растений, например, токсины, которые растения производят для отпугивания травоядных. Инструкции для этих процессов детоксикации закодированы в различных генах. Насекомые демонстрируют огромное разнообразие механизмов адаптации, что делает их интересными объектами для экологических исследований.

Учёные исследовали известный растительный токсин — никотин. Растения вида Nicotiana attenuata производят никотин как защитное вещество. Однако он не оказывает токсического действия на их главного врага — личинок табачного бражника Manduca sexta. Насекомое устойчиво к этому алкалоиду; за его резистентность могут быть ответственны гены, кодирующие никотин-катаболизирующие ферменты. Эти так называемые CYP-гены участвуют в образовании ферментов цитохрома P450; экспрессия некоторых из них повышается, как только личинки подвергаются воздействию никотина в пище. Команда Яна Болдуина идентифицировала последовательности ДНК CYP-генов у Manduca sexta и смогла «выключить» эти гены с помощью технологии RNAi, но экспрессированной в растении.

Использование растений для «выключения» генов насекомых

РНК-интерференция (RNAi) запускается за счёт производства двуцепочечной РНК (dsRNA) длиной около 300 пар оснований в клетках табака. Когда личинки питаются этими растениями, РНК высвобождается в кишечнике насекомого. В экспериментах dsRNA содержала последовательность гена насекомого CYP6B46 — специфичной для личинок Manduca sexta оксидоредуктазы цитохрома P450. Затем dsRNA ферментативно расщеплялась на более мелкие сегменты; специальный ферментный комплекс RISC (RNA-induced silencing complex), несущий несколько таких сегментов, специфично связывается с матричной РНК (мРНК) гена CYP6B46 и разрушает её так, что фермент цитохром P450 больше не может производиться.

Использование дополнительных РНК-проб для других CYP-генов выявило интересные результаты: молодые гусеницы, которые поглощали dsRNA гена CYP4M3, набирали значительно меньший вес в течение 14 дней по сравнению с личинками на контрольных растениях — вероятно, как следствие восстановления токсического эффекта никотина после «выключения» CYP-гена.

Эксперименты по RNAi проводились с использованием растительных вирусных векторов. В отличие от генетически трансформированных растений, в которых dsRNA производится конститутивно, метод на основе вирусного вектора обеспечивает временное производство dsRNA в растениях дикого типа. Оба метода работали хорошо, но «система производства dsRNA на основе растительного вируса» (VDPS) позволяет обрабатывать образцы для RNAi в четыре раза быстрее.

Однако до сих пор неясно, как отдельные этапы механизма RNAi — от производства dsRNA в растительной клетке до её поглощения в кишечнике насекомого и «выключения» генов детоксикации — взаимодействуют для достижения максимального эффекта. Один эксперимент дал интересную информацию: если в экспериментальных растениях ингибировать ферментативный этап, нарезающий dsRNA на мелкие фрагменты, количество транскриптов гена детоксикации снижалось ещё сильнее. Следовательно, процедура RNAi, опосредованная растением, может быть более эффективной, если гусеницы поглощают целую dsRNA, а не более мелкие нарезанные сегменты РНК.