Ген Prickle1 регулирует дифференцировку остеобластов лобной кости в новой животной модели

Дефектная миграция и дифференцировка остеобластов в зачатках черепа может привести к механически неполноценному черепу с увеличенными родничками и уменьшенными лобными костями. Сигнальный путь Wnt/планарной клеточной полярности (Wnt/PCP) обычно регулирует миграцию и движение клеток в тканях во время эмбрионального развития. В недавнем исследовании, проведённом Йонгом Ваном и коллегами из Центра черепно-лицевой регенерации, основное внимание уделялось гену Prickle1, ключевому компоненту пути Wnt/PCP, в контексте развития черепа.

Для исследований Ван и др. использовали мутацию с заменой смысла в гене Prickle1, названную Prickle1^Beetlejuice (Prickle^BJ). Гомозиготные мутанты Prickle^BJ/BJ 'Beetlejuice' были микроцефалами и развивали увеличенные роднички между недостаточно развитыми лобными костями, хотя теменные кости были нормальными. У гомозиготных мутантов наблюдались и другие черепно-лицевые дефекты, включая расщелину верхней губы по средней линии, неполную расщелину нёба и уменьшенный проксимально-дистальный рост головы. Учёные также обнаружили снижение сигналинга Wnt/β-катенина и hedgehog в конденсатах лобной кости гомозиготных мутантов.

Результаты опубликованы в Scientific Reports. У гомозиготных мутантов предшественники остеобластов лобной кости проходили задержанную дифференцировку наряду со сниженной экспрессией маркеров миграции, что приводило к недоразвитию лобных костей. Исследование показало, что функция белка Prickle1 важна как для миграции, так и для дифференцировки клеток-предшественников остеобластов, а его отсутствие в мутантной модели приводит к дефектам. Гомозиготные мутанты также развивали неправильное расположение выводного тракта сердца и расщелину нёба, что способствовало перинатальной смерти мышей. Таким образом, наблюдаемые фенотипические признаки проявлялись от ранних до поздних эмбриональных стадий.

В исследовании использовалась модель мутантов Beetlejuice (Bj) с точковой мутацией в гене Prickle1 (C161F), которая нарушала функцию цитоплазматического белка Prickle1. Мутации этого белка у человека обычно ассоциированы с семейной эпилепсией.

Ван и др. проанализировали кости и хрящи головы с помощью гистологических красителей алян синий и ализарин красный. Черепа гомозиготных мутантов были меньше, с уменьшенной проксимально-дистальной длиной головы и увеличенной медиально-латеральной шириной черепа. Результаты показали статистически значимое уменьшение вклада носовой кости в общую длину свода черепа у мутантов по сравнению с диким типом (Prickle^+/+). Напротив, у гомозиготных мутантов (Prickle^BJ/BJ) вклад лобной кости в общую длину увеличивался, в то время как доля теменной кости оставалась неизменной. Это указывало, что функция белка Prickle1 необходима на всех стадиях развития лобной кости.

Учёные обнаружили, что мутация Prickle1 приводит к двум нарушенным процессам во время развития лобной кости:

1. Задержанная дифференцировка остеобластов

2. Сниженная миграция в области лобной кости.

Анализ с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E), TUNEL-апоптозных тестов, подсчёта BrdU-меченых клеток и иммуногистохимии на фосфо-гистон H3 показал, что в модели нет изменений в пролиферации или гибели клеток. Следовательно, причина дефектов была в другом.

Эксперименты по РНК in situ гибридизации для оценки экспрессии щелочной фосфатазы (ALP), Osterix (OSX/Sp7) и RUNX2 (ранний маркер остеобластной коммитации) показали, что к эмбриональной стадии E15.5 экспрессия этих генов была снижена в эктокраниальном слое лобных костей мутантов по сравнению с диким типом. Учёные установили, что внутримембранное окостенение (превращение мезенхимальной ткани в кость) в лобной кости задерживается, что и приводит к гипопластическому фенотипу мутантов Beetlejuice.

Дальнейший анализ показал, что уровни канонического Wnt и Hedgehog (HH) сигналинга (необходимого для развития костей черепа) были нарушены у мутантных животных.

Наконец, in situ гибридизация к маркерам миграции остеобластов (Engrailed1 (En1), Twist1, Msx1 и Msx2) показала, что их экспрессия была снижена в зачатках лобной кости у мутантов. Это подтвердило, что функция белка Prickle1 необходима для опосредования миграции клеток-предшественников остеобластов на всех стадиях развития свода черепа.

Таким образом, Ван и др. проанализировали мутантную мышь Beetlejuice как новую модель для понимания этиологии микроцефалии. Учёные объединили генетические, молекулярные и физические механизмы в исследовании мутантов по Prickle1, чтобы показать их вклад в снижение роста черепно-лицевой области. Работа будет продолжена для понимания того, как миграция клеток и изменения в каждом отделе (мозг, свод черепа и основание черепа) способствуют развитию микроцефалии и формированию черепа.