Высокая специфичность прайм-редакторов в растениях подтверждена
Прайм-редактирование (PE) — это техника редактирования генома на основе CRISPR по принципу «найти и заменить». Она обладает большим потенциалом для генной терапии и сельского хозяйства, позволяя вносить в целевые участки генома нужные замены оснований, делеции, инсерции и их комбинации. Хотя прайм-редакторы успешно применялись на животных и растениях, их нецелевые эффекты (off-target), которые могут быть серьёзным препятствием для практического использования, до сих пор не были всесторонне оценены.
Команда профессора Гао Цайся из Института генетики и биологии развития Китайской академии наук провела полный геном-широкий анализ нецелевых эффектов PE в растениях риса. Эти эффекты делятся на два типа: зависимые от гидовой РНК (gRNA) и независимые от gRNA. Первые возникают из-за сходства целевой и нецелевой последовательностей, а вторые — из-за активности компонентов CRISPR (например, деаминазы) в случайных участках генома.
Специфичность, зависимая от гидовой РНК
Исследователи оценили частоту редактирования с помощью pegРНК, у которых участки связывания праймера (PBS) или спейсеры содержали несовпадения с целевой последовательностью. Оказалось, что:
- Несовпадения в seed-последовательности спейсера (близко к PAM) и рядом с сайтом разрезания nCas9 (H840A) в PBS значительно снижали частоту PE, что указывает на высокую специфичность.
- Частоты редактирования 12 pegРНК на 179 эндогенных нецелевых сайтах с несовпадениями были крайне низкими (0.00%–0.23%).
Отсутствие значимых независимых от gRNA эффектов
Независимые от gRNA эффекты, вызванные эктопической экспрессией компонентов системы (известные для некоторых базовых редакторов), нельзя предсказать in silico. Поэтому учёные использовали полногеномное секвенирование.
- Конструкции PE с кассетой экспрессии pegРНК и без неё доставляли в каллус риса с помощью агробактериальной трансформации для получения регенерированных растений T0.
- Количество однонуклеотидных вариантов и небольших инделов в группе PE не было значимо выше, чем в контрольной группе (экспрессирующей Cas9-никазу).
- Анализ типов и распределения мутаций также не выявил значимых различий между группами.
Безопасность обратной транскриптазы M-MLV
Поскольку M-MLV обратная транскриптаза (RT) — ключевой элемент системы PE, учёные проверили, не нарушает ли её сверхэкспрессия клеточные механизмы.
- Не было обнаружено влияния на активность ретротранспозонов (на примере OsTos17) и теломеразы (сохранность теломер).
- Также не было выявлено случайных вставок pegРНК или мРНК в геном риса в результате неспецифической обратной транскрипции.
Вывод: Систематическая оценка показала, что прайм-редакторы обладают высокой специфичностью в растениях. Работа под названием «Genome-wide specificity of prime editors in plants» была опубликована в журнале Nature Biotechnology 15 апреля.