Ученые повысили эффективность прайм-редактирования растений с помощью оптимизированных pegРНК
Точное редактирование генома позволяет модифицировать ДНК в живых клетках, открывая широкие возможности для селекции растений. Прайм-редакторы, разработанные профессором Дэвидом Р. Лю и его коллегами, позволяют вносить заданные изменения в программируемый участок-мишень. Они состоят из слияния инженерной никказы Cas9 (H840A) с обратной транскриптазой (RT) и направляющей РНК для прайм-редактирования (pegРНК).
Ранее профессор Гао Цайся из Института генетики и биологии развития (IGDB) Китайской академии наук вместе с исследовательской группой и коллабораторами разработала и оптимизировала прайм-редакторы как универсальную стратегию для создания программируемых точечных мутаций, вставок и делеций в рисе и пшенице.
Они обнаружили, что эффективность редактирования растительного прайм-редактора сильно зависит от последовательности PBS и RT-матрицы, что указывает на необходимость оптимизированного дизайна pegРНК для получения более высокого выхода продукта.
Чтобы определить принципы эффективного прайм-редактирования, профессор Гао и профессор Ли Цзяян (также из IGDB) вместе со своими командами представили оптимизированные стратегии дизайна pegРНК, которые максимизируют эффективность прайм-редактирования в растениях.
Поскольку гибридизация сайта связывания праймера (PBS) с одноцепочечной ДНК нетаргетной цепи является первым шагом в обратной транскрипции, исследователи предположили, что температура плавления (Tm) последовательности PBS (далее PBS Tm) — важный параметр для прайм-редакторов. Проанализировав эффективность прайм-редактирования на 18 эндогенных сайтах-мишенях в протопластах риса, они обнаружили, что PBS Tm сильно влияет на эффективность редактирования, причем максимальная эффективность достигается при PBS Tm в 30 °C в рисе.
Помимо определения оптимального дизайна pegРНК, они также усовершенствовали прайм-редактирование, используя двойные pegРНК. Эта стратегия основана на двух pegРНК, генерирующих соответствующие одноцепочечные фланкирующие последовательности, которые спариваются друг с другом in trans, кодируя одно и то же изменение на обеих цепях вновь синтезированной ДНК.
Этот новый подход привел к увеличению средней эффективности прайм-редактирования в 3.0 раза по сравнению с использованием отдельных pegРНК. Кроме того, ученые создали прайм-редакторы на основе SpG (инженерной Cas9 с расширенным диапазоном PAM), чтобы расширить спектр мишеней для этой стратегии с двойными pegРНК. В совокупности оптимизация PBS Tm и использование стратегии двойных pegРНК повысили эффективность прайм-редактирования в рисе до 17.4 раз.
На основе этих двух достижений команда разработала удобное веб-приложение PlantPegDesigner, чтобы помочь другим исследователям создавать инструменты прайм-редактирования, наиболее подходящие для их задач.
PlantPegDesigner предоставляет пользователям гибкость и контроль над различными параметрами в соответствии с их потребностями. Этот инструмент рекомендует последовательности спейсер-PAM, PBS, RT-матрицы, а также праймеры для ПЦР-клонирования для конструирования векторов. По сравнению с другими веб-приложениями, двойные pegРНК, рекомендованные PlantPegDesigner, привели к увеличению редактирующей активности в рисе до 46 раз.
Таким образом, эта работа упростила дизайн pegРНК, предоставив надежное решение для эффективного прайм-редактирования в растениях. Гибкость оптимизированной системы прайм-редактирования растений будет способствовать прогрессу как в селекции растений, так и в исследованиях функциональной геномики.
Исследование под названием "High-efficiency prime editing with optimized, paired pegRNAs in plants" было опубликовано в журнале Nature Biotechnology онлайн 25 марта.