Мультивариантный анализ плюрипотентных клеток человека выявил индуцированные паракринные факторы в развитии почечных органоидов

Биоинженеры добились значительных успехов в создании сложных многоклеточных почечных органоидов (крошечных самоорганизующихся тканей) в лаборатории из плюрипотентных стволовых клеток. Однако стандартные методы тканевых культур ограничивают эксперименты по улучшению процедур для различных целей, включая паттернинг и созревание специфических типов клеток.

В статье в Science Advances междисциплинарная команда исследователей из Австралии описала новый метод на основе полнофакторного массива микробиореакторов (MBA) для проведения сложной дифференцировки в лаборатории.

Метод и результаты

Используя этот метод, учёные быстро исследовали и оптимизировали сложный процесс дифференцировки и развития клеток. Они успешно воспроизвели ранние события тканевого паттернинга почки и изучили более 1000 уникальных условий для достижения почти чистой спецификации почечных типов клеток.

Команда провела идентификацию различных почечных типов клеток в многослойных органоидах с разрешением на уровне одной клетки и связала результаты с многомерным анализом, чтобы определить роли нескольких сигнальных белков. Биоинженеры отметили, что ретиноевая кислота (RA) оказывает минимальное влияние на паттернинг нефронов, в то время как индуцированные паракринные факторы вносят значительный вклад в спецификацию и паттернинг клеток.

Экспериментальная часть

В экспериментах команда засеяла MBA шестидневными предшественниками промежуточной мезодермы (IM), полученными из клеток человеческих эмбриональных стволовых клеток (HES3). Они исследовали влияние трёх молекул: фактора роста фибробластов 9 (FGF9), костного морфогенетического белка 7 (BMP7) и ретиноевой кислоты (RA).

Используя вложенную резистивную сеть внутри MBA, учёные разделяли и рекомбинировали питательную среду с тремя факторами в разных концентрациях в течение 9 или 12 дней. Культура в течение 12 дней привела к формированию значительно более сложных и зрелых структур.

Ключевые выводы

• Многомерный регрессионный анализ показал, что FGF9 является жизненно важным фактором для пролиферации клеток и поддержания всех типов клеток.
• BMP7 увеличивал общее количество клеток, влияя на пропорции спецификации клеток во время ранней дифференцировки почки.
• RA не играла роли на этапе ранней дифференцировки почки, которая, по-видимому, зависела от короткой двухдневной активации WNT в начале культивирования клеток.
• Данные показали, что небольшие пошаговые изменения экзогенных факторов (FGF9, BMP7, CHIR), а также эндогенной сигнализации в форме паракринных и аутокринных факторов могут смещать соотношение дифференцировки клеток.

В результате из предшественников IM были получены фенотипические клетки мочеточника, метанефрогенной мезенхимы (MM), ранних проксимальных нефронов (EPN) и дистальных нефронов (DN).

Значение работы

Показана возможность точного направления дифференцировки стволовых клеток в лаборатории для формирования почечной ткани и отдельных типов почечных клеток. Это важный шаг на пути к применению в регенеративной медицине и открытии лекарств.

MBA-подход может быть применён для получения сложной, многоступенчатой дифференцировки с многоклеточными результатами и позволит настраивать дифференцировку других органоидоподобных тканей, полученных из плюрипотентных стволовых клеток.