Взаимодействие OPTN-ATG9 ускоряет аутофагическую деградацию меченных убиквитином митохондрий
Исследователи из TMIMS выяснили, что PINK1 (серин/треониновая киназа) и Parkin (убиквитинлигаза: E3) совместно убиквитинируют белки внешней мембраны поврежденных митохондрий, чтобы запустить селективную аутофагию — митофагию. Дисфункция этого процесса приводит к снижению качества митохондрий и перепроизводству АФК, что связано с развитием наследственной рецессивной болезни Паркинсона.
В клетках убиквитин служит сигналом для селективной аутофагии. Предполагается, что в этом участвуют адаптерные белки аутофагии, которые связываются как с убиквитином, так и с факторами формирования аутофагосом. Клетки млекопитающих кодируют пять таких адаптеров (p62, NBR1, TAX1BP1, NDP52, OPTN), причем OPTN и NDP52 играют ключевую роль в митофагии, опосредованной PINK1/Parkin. Однако молекулярные механизмы их действия оставались неясными. Также было спорным, служат ли PINK1 на поврежденных митохондриях и/или фосфорилированный убиквитин прямым сигналом для аутофагии. В этом исследовании Ямано и коллеги из TMIMS прояснили новый механизм, с помощью которого убиквитиновая цепь, созданная PINK1/Parkin, считывается как сигнал аутофагии.
Убиквитиновая цепь сама по себе достаточна для митофагии
Сначала ученые обнаружили, что митофагию можно индуцировать линейной убиквитиновой цепью, искусственно нацеленной на внешнюю митохондриальную мембрану, или химическим соединением SNIPER, вызывающим убиквитинирование специфического белка внешней мембраны. Эти результаты показывают, что убиквитиновая цепь на поверхности митохондрий сама по себе необходима и достаточна для митофагии, а PINK1 и фосфорилированный убиквитин необходимы для активации Parkin, но не для самой митофагии.
Адаптеры OPTN и NDP52 локализуются в специфических субдоменах
Исследовав внутриклеточную локализацию адаптерных белков (p62, NBR1, NDP52, OPTN) после индукции митофагии, ученые обнаружили, что все они рекрутируются на поврежденные митохондрии. Однако p62 и NBR1 распределялись по митохондриям равномерно, а NDP52 и OPTN локализовались только на ограниченных участках. Поскольку в этих же субдоменах находился маркер аутофагосом LC3B, было высказано предположение, что NDP52 и OPTN специфически накапливаются в местах контакта между убиквитинированными митохондриями и формирующимися аутофагосомами.
OPTN специфически взаимодействует с ATG9A, а не с LC3
Используя систему Fluoppi (для визуализации взаимодействий белков в виде флуоресцентных фокусов), ученые выяснили, что фокусы, образованные p62 или NBR1, содержали больше белков семейства LC3, чем фокусы от NDP52 или OPTN. Поскольку p62 и NBR1 не являются обязательными для митофагии, это говорит о том, что ключевая роль OPTN и NDP52 обусловлена не только их способностью связывать LC3.
Поиск партнеров среди белков аутофагии (ATG) показал, что ATG9A полностью колокализуется с фокусами OPTN, но не наблюдается в фокусах, образованных другими адаптерами. Это указывает на специфическое взаимодействие OPTN с ATG9A.
Лейциновая молния OPTN критически важна для связывания ATG9A и митофагии
С помощью делеционных мутантов и точечных замен аминокислот было установлено, что лейциновая молния (leucine zipper domain) в OPTN необходима для связывания с ATG9A. Мутантный OPTN с изменением в этом домене формировал фокусы с убиквитином, как и дикий тип, но рекрутирование ATG9A в эти фокусы полностью нарушалось.
Функциональный анализ с помощью MtKeima-FACS показал, что в клетках, лишенных всех адаптеров аутофагии, митофагия исчезала. Экспрессия дикого OPTN восстанавливала митофагию, тогда как OPTN с мутацией в лейциновой молнии восстанавливал ее лишь незначительно (на 18% по сравнению с диким типом). Это доказывает, что взаимодействие OPTN-ATG9A через домен лейциновой молнии критически важно для митофагии, опосредованной PINK1/Parkin.
Два пути запуска митофагии
Ранее было показано, что другой ключевой адаптер, NDP52, взаимодействует с FIP200, компонентом комплекса инициации аутофагии. Данное исследование выявило, что OPTN связывается с ATG9A (важным фактором, поставляющим липиды для аутофагических мембран). Таким образом, митофагия, индуцированная PINK1/Parkin, протекает по двум осям: убиквитин-NDP52-FIP200 и убиквитин-OPTN-ATG9A.
"Адаптеры аутофагии определялись как белки, способные связывать и убиквитин, и LC3. Однако последние работы, включая наше исследование, подчеркивают важность новых взаимодействий между адаптерами и основными компонентами аппарата аутофагии", — сказал доктор Ямано. — "В будущем мы планируем применить этот экспериментальный подход к другим адаптерам, чтобы идентифицировать новых партнеров в селективной аутофагии".