Учёные создали не встречающийся в природе фермент для эффективных синтетических метаболических путей
Исследователи под руководством Тобиаса Эрба из Института наземной микробиологии Макса Планка в Марбурге разработали новый фермент — «лактоил-КоА мутазу». Он способен эффективно превращать ключевое метаболическое соединение в ценные продукты.
Для этого команда использовала эволюцию, чтобы «натренировать» способности природного фермента в лаборатории. Цель работы — найти будущее применение для улавливания и устойчивого использования парникового газа CO2. Исследование опубликовано в Nature Communications.
Немногие строительные блоки клеточного метаболизма так же центральны и универсальны, как ацетил-кофермент А (ацетил-КоА). Его использование в клетке определяет, сколько биомассы может быть образовано, что в итоге влияет на эффективность использования парникового газа CO2 в биотехнологических процессах.
Чтобы создать из ацетил-КоА другие продукты и химические вещества, его часто нужно сначала превратить в клеточные промежуточные соединения с тремя атомами углерода, например, в пируват. В природе метаболические пути для этого либо неэффективны, либо включают много шагов, либо работают только в отсутствие кислорода. Это означает, что при превращении ацетил-КоА в пируват либо теряется ценный углерод, либо пути настолько длинны, что тратят клеточные ресурсы.
Поэтому команда Тобиаса Эрба задалась целью создать новый, эффективный метаболический «мост» между ацетил-КоА и пируватом, который также позволил бы эффективно улавливать и использовать CO2. Исследование проводилось совместно с учёными из Института молекулярной физиологии растений Макса Планка в Потсдаме.
Поиск, начатый с теоретического дизайна
В синтетической биологии новые метаболические пути сначала проектируют на бумаге, а затем тестируют в лаборатории. Команда наметила теоретический маршрут, который связывал бы дополнительный CO2 и был короче известных путей.
Проблема заключалась в том, что ключевая ферментативная активность, необходимая для этого процесса, — «лактоил-КоА мутаза» — изначально была чисто теоретической. Эта активность ранее не была описана в природе. Поиск в базах данных ферментов позволил выявить перспективного кандидата, чья структура казалась подходящей. В экспериментах этот фермент действительно мог действовать на предоставленный субстрат, но работал крайне медленно.
Как «натренировать» медленный фермент?
«В природе постоянная адаптация, движимая мутациями и отбором, со временем приводит к улучшению признаков. Мы использовали этот процесс в ускоренной версии в лаборатории, чтобы оптимизировать наш фермент», — объясняет Хелена Шульц-Мирбах, докторант в команде Тобиаса Эрба и один из первых авторов исследования.
«Чтобы предотвратить потерю вновь обретённой способности из-за дальнейших мутаций, мы связали рост модифицированной бактерии Escherichia coli с желаемой ферментативной активностью. Создание штамма, который мог бы использовать этот медленный фермент для своего роста, было нетривиальной задачей».
Тренировка в живом организме
На втором этапе этот штамм подвергли ускоренной эволюции в лаборатории — процессу, называемому «адаптивной лабораторной эволюцией (ALE)». Мутации вводили, а затем отбирали на основе желаемых признаков. Полученные варианты лактоил-КоА мутазы стали не только быстрее и лучше поддерживали рост бактерий, но, что важно, они также функционировали вне бактерий в упрощённом химическом процессе в пробирке (in vitro). Здесь улучшенный фермент показал в 5–10 раз лучшую производительность по сравнению со своим природным предшественником.
«Наше исследование — яркий пример того, как мы можем использовать механизмы метаболизма и эволюции в живых клетках для оптимизации желаемого свойства для применения в синтетической биологии и бесклеточной биохимии. Только объединив эти подходы, мы смогли выявить улучшенные варианты фермента», — говорит Филипп Вичманн, руководивший работой in vitro.
Дальнейшая оптимизация и цели исследований
«Однако наш фермент всё ещё нуждается в улучшении: по сравнению с другими ферментами в природе лактоил-КоА мутаза всё ещё довольно медленная», — добавляет доктор Ари Сатановски, помогавший в проектировании и руководстве проектом. Основная цель будущих исследований — сделать этот фермент быстрее, чтобы его можно было использовать в различных приложениях.
Этот совершенно новый метаболический путь между ацетил-КоА и пируватом открывает новые возможности, например, для производства 3-гидроксипропионата — предшественника для устойчивых биопластиков.
«Мы также хотим больше узнать о самом ферменте, — говорит Хелена Шульц-Мирбах. — Хотя мы знаем, какие мутации улучшили его активность, мы ещё не понимаем, как именно они этого добились. Определив структуру фермента, мы надеемся раскрыть больше о его механизме реакции и эффектах этих мутаций».