Генно-инженерная клеточная терапия с использованием мРНК-липидных наночастиц для получения трансфузионных тромбоцитов
Тромбоцитарные трансфузии необходимы для контроля кровотечений и гемостатической дисфункции, а также могут быть расширены для использования в качестве клеточной терапии различных заболеваний. Создание таких методов требует модификации донорских тромбоцитов для экспрессии терапевтических белков, однако подходящие способы генетической модификации тромбоцитов, полученных от доноров крови, до сих пор не найдены.
В новом исследовании, опубликованном в Science Advances, Джерри Леунг и команда ученых в области наномедицины, биохимии и молекулярной биологии из Университета Британской Колумбии (Канада), Университета Хоккайдо (Япония) и ряда институтов США описали подход на основе оптимизированных для тромбоцитов липидных наночастиц, содержащих мРНК, для экспрессии экзогенных белков в человеческих и крысиных тромбоцитах.
При тестировании библиотеки мРНК-липидных наночастиц экспрессия экзогенного белка не коррелировала с активацией тромбоцитов. Трансфецированные тромбоциты сохраняли гемостатическую функцию и накапливались в зонах сосудистых повреждений после переливания крысам, что расширяет их терапевтический потенциал.
Липидные наночастицы обеспечивают экспрессию экзогенных белков в тромбоцитах
Для поиска эффективных методов трансфекции тромбоцитов команда доставляла мРНК, кодирующую фермент NanoLuc люциферазу (NanoLuc), с помощью нескольких агентов и измеряла ее экспрессию. Экспрессия NanoLuc не обнаруживалась в тромбоцитах, обработанных свободной мРНК без агента трансфекции или коммерческими агентами доставки мРНК, однако процесс позволял захватывать большое количество мРНК.
Леунг и команда обнаружили экспрессию NanoLuc при использовании формуляции мРНК-липидных наночастиц, напоминающей клинически одобренные малые интерферирующие РНК-липидные наночастицы для лечения наследственного амилоидоза. Уровень активации тромбоцитов после трансфекции сравнивали с необработанными тромбоцитами.
Для определения оптимальной формулы мРНК-липидных наночастиц для доставки в тромбоциты они оптимизировали три основных компонента: ионизируемые липиды, линкерные липиды и полиэтиленгликолевый липид. Было протестировано 10 ионизируемых и два постоянно катионных липида с измерением экспрессии белка, захвата мРНК и активации.
Действие функционализированных липидных наночастиц in vitro
Изучая синергетический эффект комбинации ионизируемых и вспомогательных липидов для усиления экспрессии белка при минимальной активации тромбоцитов, команда исследовала два одобренных FDA ионизируемых липида. Помимо липидного состава, важную роль в эффективном синтезе экзогенного белка играли элементы мРНК. Наночастицы, содержащие вспомогательные липиды с фосфохолиновой головкой, а также липиды с разветвленными или ненасыщенными хвостовыми группами, лучше всего подходили для трансфекции тромбоцитов и обеспечивали более высокий уровень экспрессии.
Среди модификаций РНК, протестированных в работе, немодифицированный уридин или псевдоуридин способствовали более высоким уровням экспрессии флуоресценции. Анализ корреляционной матрицы показал, что экспрессия флуоресценции сильно не коррелировала ни с уровнем активации тромбоцитов, ни с количеством доставленной РНК, хотя наблюдалась слабая положительная корреляция между количеством доставленной РНК и активацией тромбоцитов.
Поскольку экспрессия NanoLuc также сильно не коррелировала с этими параметрами, команда проверила возможность влияния на ее экспрессию путем активации тромбоцитов агонистами до и после трансфекции. Тромбоциты, стимулированные аденозиндифосфатом, коллаген-связанным пептидом или тромбином перед обработкой мРНК-липидными наночастицами, имели значительно меньшую экспрессию флуоресценции. Это показало, что трансляция экзогенной мРНК не требует активации тромбоцитов.
Терапия тромбоцитами для моделирования разводняющей коагулопатии
Тромбоциты, обработанные мРНК-липидными наночастицами, сохраняли гемостатическую функцию in vitro. Исследователи проверили, могут ли трансфецированные тромбоциты активироваться после обработки, измерив их состояние активации и реакцию на физиологические агонисты.
Способность трансфецированных тромбоцитов вносить вклад в плотность и скорость образования сгустка была протестирована с помощью модели ротационной тромбоэластометрии и ex vivo модели активности тромбоцитов в цельной крови. Ученые смоделировали разводняющую коагулопатию, используя разведенную цельную кровь и приготовив тромбоциты в трансфузионном пакете.
При комбинации трансфузионного пакета с разведенной цельной кровью для моделирования заболевания было отмечено, что липидные наночастицы не влияли на коррекцию коагулопатии тромбоцитами in vitro. Кроме того, команда изучила, как тромбоциты, трансфецированные мРНК-липидными наночастицами с экспрессией NanoLuc, циркулируют и локализуются в местах ранения после переливания коагулопатичным грызунам.
Перспективы
Таким образом, Джерри Леунг и коллеги нацелили доставку молекул и клеточной терапии в интересующие участки сосудистой системы, используя естественную способность тромбоцитов выполнять эту задачу. Команда разработала оптимизированные для тромбоцитов липидные наночастицы и мРНК для успешной экспрессии белков, при этом тромбоциты сохраняли циркуляторную функцию и локально накапливались в целевом участке сосудов.
Доставка нуклеиновых кислот и экзогенная трансляция с помощью оптимизированных для тромбоцитов мРНК-липидных наночастиц возможна и позволяет модифицировать тромбоциты для различных клинических применений. Такие донорские тромбоциты, созданные с помощью мРНК-липидных наночастиц, могут лечить острые кровотечения и имеют более широкое применение в онкологии. Эти тромбоциты, трансфецированные оптимизированными мРНК-липидными наночастицами, являются функционально пригодными для переливания и могут накапливаться в сосудистом участке для эффективной терапии, модулирующей гематологические нарушения.