Как выделить микробную иголку из стога сена микробного сообщества

Исследователи из Института морской микробиологии Макса Планка разработали, протестировали и применили конвейер для целенаправленного выделения клеток из сообществ некультивируемых микробов с последующей эффективной сборкой и характеристикой их геномов.

Несмотря на прогресс в секвенировании геномов микробов с помощью метагеномики и одноклеточной геномики, большинство микробов, играющих ключевую роль в глобальных биогеохимических циклах, остаются неисследованными. Целевой подход позволил бы фокусироваться на конкретных микроорганизмах в образцах.

Традиционный подход shotgun-метагеномики начинается с секвенирования всего сообщества и последующего вычленения последовательностей интересующих микробов. Когда целевой микроб составляет крошечную долю сообщества, поиск его генома становится крайне сложным.

Чтобы преодолеть это препятствие, команда под руководством Бернхарда Фукса и постдока Анниссы Гриб разработала в сотрудничестве с Объединенным институтом генома (JGI) Министерства энергетики США протокол для более легкого выявления целевых клеток в сложном образце и их сортировки для последующего секвенирования ДНК. Протокол, описанный в журнале Microbiome, сочетает несколько методов и был продемонстрирован на группе морских бактерий "Vis6", встречающихся в цветении водорослей Северного моря.

Рабочий процесс начинается с мечения конкретных клеток с помощью гибридизационной цепной реакции флуоресцентной in situ гибридизации (HCR-FISH). В отличие от стандартного FISH, где один зонд добавляет одну флуоресцентную молекулу, HCR-FISH присоединяет множество флуоресцентных меток к одному сайту связывания, что приводит к значительно более яркому сигналу от целевых клеток. Усиление сигнала HCR-FISH критически важно для обнаружения, так как клетки из природных сред обычно слишком тусклы для проточной цитометрии при использовании стандартных зондов FISH. После мечения HCR-FISH клетки собирают с помощью сортировки активированных флуоресценцией клеток (FACS) в менее разнообразные пулы перед секвенированием генома. В ходе разработки метода также тестировались различные протоколы фиксации; было обнаружено, что обработка этанолом улучшает флуоресцентные сигналы, не мешая последующей амплификации и секвенированию ДНК.

В качестве доказательства концепции команда протестировала конвейер HCR-FISH+FACS на метагеномах Северного моря. Используя специфичный для группы Vis6 зонд, им удалось увеличить долю этой группы с менее чем одного процента последовательностей в общем метагеноме до более чем 50% прочтений в целевом метагеноме. Это демонстрирует жизнеспособность HCR-FISH+FACS для селективного обогащения микробных групп с низкой численностью в сложных природных сообществах. Такой тип обогащения может применяться для получения более полного представления о генетическом составе популяции и идентификации взаимодействующих с ней вирусов.

Разработка этого протокола стала возможной благодаря Программе возможностей новых технологий (ETOP) JGI. ETOP помогает исследователям развивать технологии, которые затем становятся доступными пользователям JGI для решения актуальных энергетических и экологических задач.