Все будет освещено: многоцветная визуализация в реальном времени с люминесцентными белковыми Nano-lanterns

Люминесцентная визуализация (биолюминесценция) не требует возбуждающего света, что позволяет избежать проблем флуоресцентной микроскопии: автофлуоресценции, фотодеградации (фотовыцветания) и фотоповреждения клеток. Однако существующие люминесцентные белки были слишком тусклыми и имели мало цветовых вариантов.

Ученые из RIKEN и Университета Осаки создали новые яркие версии люминесцентных белков Nano-lanterns цианового (CNL) и оранжевого (ONL) цветов. Они примерно в 20 раз ярче, чем природный фермент Renilla luciferase (Rluc), выделенный из мягких кораллов Renilla.

Как это работает: Яркость достигнута за счет резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET) от улучшенного Rluc к флуоресцентному белку (mTurquoise2 для CNL). Для создания ONL методом проб и ошибок была найдена оптимальная комбинация из сотен вариантов оранжево-красных флуоресцентных белков и вариантов Rluc.

Ключевые преимущества и применения:

1. Визуализация быстрой динамики органелл. Nano-lanterns позволили впервые наблюдать быстрые движения эндосом и пероксисом с временным разрешением около 1 секунды. Ранее для тусклых люминесцентных зондов требовалась выдержка в 10 минут и более.

2. Длительная визуализация без фотоповреждений. Ученые непрерывно наблюдали динамику фокальных адгезий в движущихся клетках в течение более 6 часов без фотодеградации сигнала или остановки движения клеток. При флуоресцентной визуализации с непрерывной подсветкой клетки останавливаются и погибают за 10 минут.

3. Совместимость с оптогенетикой. Это главная перспектива технологии. Поскольку Nano-lanterns не требуют внешнего света, его можно использовать исключительно для оптической стимуляции в оптогенетике. Это решает проблему конфликта, когда и флуоресцентный зонд (например, для ионов Ca²⁺), и оптогенетический инструмент управляются светом одного цвета. На основе CNL и ONL уже созданы индикаторы Ca²⁺, полностью совместимые с оптогенетикой.

4. Многоцветная визуализация и низкий фон. Спектры излучения Nano-lanterns такие же узкие, как у флуоресцентных белков, что позволяет эффективно разделять цвета с помощью алгоритмов. Фон при люминесцентной визуализации практически отсутствует из-за отсутствия автофлуоресценции, что повышает чувствительность и количественную точность.

Текущие ограничения и будущие задачи:

• Яркость: Сигнал Nano-lanterns все еще в 100+ раз слабее, чем у флуоресцентных белков при их максимальной яркости. Однако в условиях обычной live-cell визуализации (где мощность возбуждения снижена, чтобы избежать фотодеградации) разница становится намного меньше.
• Субстрат: Длительность визуализации ограничена запасом субстрата коелентеразина. Для сверхдолгих наблюдений (>12 часов) требуется система его перфузии. Будущая задача — создание системы регенерации или синтеза субстрата in vivo.
• Аксиальное разрешение: Люминесцентная визуализация на обычном микроскопе имеет худшее аксиальное разрешение (глубину) по сравнению с флуоресцентной. Это критично для in vivo приложений, и над решением этой проблемы ведется работа.

Вывод: Nano-lanterns делают люминесцентную визуализацию практической альтернативой флуоресцентной в случаях, когда критически важно избежать фотоповреждения чувствительных образцов (эмбриональные стволовые клетки, яйцеклетки) или когда необходимо совместить наблюдение с оптогенетической стимуляцией.