Новый метод изоляции органелл позволяет изучить пероксисомы
Для понимания клеточной биологии важно исследовать не только целые клетки, но и отдельные органеллы — специализированные структуры внутри клетки. Однако большинство методов анализа работает на уровне целой клетки. Содержимое конкретной органеллы составляет лишь малую часть клетки, поэтому «фоновый шум» от других компонентов может заглушать полезную информацию, например, об изменениях в уровнях белков или метаболитов органеллы.
Исследователи под руководством Дэвида Сабатини (Whitehead Institute) и Уолтера Чена разработали метод изоляции органелл для анализа, который превосходит предыдущие по скорости и специфичности очистки. Метод впервые применили к митохондриям (опубликовано в Cell в 2016 г.), затем к лизосомам (Science, 2017), а также адаптировали для работы на мышах (PNAS, 2019). Теперь, в статье в iScience от 22 мая, Сабатини, Чен и аспирант Джордан Рэй расширили метод для изучения пероксисом — органелл, играющих ключевую роль в физиологии человека.
«Приятно видеть, как этот инструментарий расширяется, позволяя нам глубже понять нюансы биологии этих органелл», — говорит Сабатини.
Суть метода: органеллярная иммунопреципитация
Метод основан на органеллярной иммунопреципитации. Для каждого типа органелл создают специальную метку: эпитоп (участок, который распознают антитела) сшивают с белком, локализующимся на мембране целевой органеллы. Клетки с помеченными органеллами разрушают, высвобождая содержимое, и помещают в раствор с магнитными шариками, покрытыми антителами. Антитела связываются с меткой на органеллах. С помощью магнита шарики с прикреплёнными органеллами отделяют от остального клеточного материала, а загрязнения отмывают. Изолированные органеллы затем анализируют на содержание метаболитов, липидов и белков.
Ключевые преимущества метода:
- Скорость: новая версия для пероксисом изолирует помеченные органеллы за 10 минут после высвобождения из клеток. Это важно, поскольку естественный профиль метаболитов и белков органелл начинает меняться сразу после выделения.
- Специфичность и воспроизводимость: метод позволяет чётко отделять целевые органеллы от фонового шума.
«Благодаря скорости и специфичности этих методов мы можем не только точнее оценить исходный метаболический профиль конкретной органеллы, но и изучать белки, которые могут иметь более кратковременные взаимодействия с органеллой», — отмечает Чен.
Пероксисомы в центре внимания
Пероксисомы важны для множества метаболических процессов и выполняют essential биологические функции, например, участвуют в производстве миелиновых оболочек нейронов. Дефекты в работе пероксисом лежат в основе различных генетических нарушений у детей и связаны с нейродегенеративными заболеваниями. Однако по сравнению с другими органеллами, такими как митохондрии, пероксисомы изучены относительно слабо.
Новый метод, разработанный для пероксисом, является не только быстрым и специфичным, но и воспроизводимым и простым в использовании.
«Биология пероксисом весьма увлекательна, и остаётся много открытых вопросов об их формировании, созревании и роли в заболеваниях, на которые, надеюсь, этот инструмент поможет ответить», — говорит Рэй.
Перспективы
Следующим шагом может стать адаптация метода изоляции пероксисом для работы на модельных организмах млекопитающих, например, мышах, что уже было успешно сделано для митохондрий.
«Использование этого метода на животных может быть особенно полезно для изучения пероксисом, поскольку они участвуют в различных функциях, essential на уровне организма, а не отдельной клетки», — поясняет Чен.
Пока Чен планирует использовать метод для профилирования содержимого пероксисом в specific типах клеток различных органов млекопитающих, другие исследователи в лаборатории Сабатини уже работают над расширением метода на другие органеллы.