Понимание фундаментальных метаболических процессов клетки в меняющейся среде
Генетик Скотт Бейкер изучает мутантов дрожжей Yarrowia lipolytica — маслопродуцирующих микроорганизмов, которые он и его коллабораторы из MIT, UCLA и Технологического университета Чалмерса (Швеция) надеются использовать для производства биотоплива. Этот проект, финансируемый Управлением биологических и экологических исследований Министерства энергетики США (DOE), является примером комплексного подхода к метаболомике — науке о полном наборе малых молекул (метаболитов) в клетке.
Мультиметодный подход к анализу метаболизма
Для анализа метаболизма Y. lipolytica ученые используют несколько методов:
- Экстракция метанолом/хлороформом разделяет клеточное содержимое на три фракции: полярные метаболиты (углеводы, аминокислоты), липиды и белки.
- Газовая хроматография-масс-спектрометрия (GC-MS) — основной метод для анализа полярных метаболитов с высокой достоверностью идентификации, благодаря наличию обширных референсных библиотек (например, от Agilent, содержащей данные по 700 метаболитам).
- Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS) используется для анализа сложных липидов (например, триацилглицеридов), которые не подходят для GC-MS. Ученые PNNL создают собственную библиотеку для липидомики.
- Дополнительные методы (проточная цитометрия, микроскопия, масс-спектрометрическая визуализация) помогают изучать пространственное и временное распределение липидов в клетке.
Цель — выйти за рамки простого «омиксного» анализа и увидеть метаболомику во времени и пространстве, понять перемещение метаболитов внутри клетки и между микроорганизмами в сообществе.
ЯМР-спектроскопия: анализ в нативном состоянии
В отличие от масс-спектрометрии, требующей ионизации и часто фрагментации образца, ЯМР-спектроскопия позволяет анализировать химические смеси, не разрушая образец. В EMSL установлено 11 приборов ЯМР.
Преимущества ЯМР:
- Возможность различать изомеры.
- Детекция молекул, которые не ионизируются.
- Работа с образцами с высокой концентрацией солей (например, морская вода).
- Минимальная пробоподготовка.
Ученые EMSL разработали биореактор, позволяющий выращивать микроорганизмы непосредственно в магнитной камере ЯМР и в реальном времени наблюдать за образованием и исчезновением метаболитов. Эта технология применяется для изучения почвенных микробных сообществ, микрофлоры кишечника и микроорганизмов для производства биотоплива.
От данных к предсказательным моделям
Измерения метаболитов недостаточно. Для понимания и, главное, прогнозирования работы клетки необходимы вычислительные модели, учитывающие кинетику и термодинамику.
Команда Билла Кэннона в PNNL строит термодинамические модели метаболических циклов. В отличие от кинетических моделей, требующих учета скоростных параметров для каждой реакции, термодинамический подход фокусируется на вероятности того или иного состояния системы, основанной на энергии. Это позволяет предсказывать реальные концентрации метаболитов, которые затем можно проверить экспериментально.
Для выполнения сложных симуляций с добавлением новых метаболических путей используется суперкомпьютер Cascade.
Ключевая цель, по словам ученого EMSL Стивена Уайли, — создание предсказательной модели работы клетки, которую можно было бы использовать для ее целенаправленного конструирования. Без возможности измерять множество метаболитов и промежуточных соединений проверить такие модели невозможно. Ученые EMSL и их пользователи последовательно решают эту задачу, анализируя один метаболит, один путь или одну симуляцию за раз.