Краткая история экспансионной микроскопии
Современные технологии визуализации позволяют ученым рассматривать мельчайшие синапсы, через которые нейроны общаются друг с другом, и даже молекулы, передающие сигналы. Эта детализация стала возможна не только благодаря мощным микроскопам, но и благодаря методике, разработанной в лаборатории Эдварда Бойдена из McGovern Institute for Brain Research (MIT). Исследователи по всему миру теперь могут изучать образцы, увеличенные в размерах до 20 раз, чтобы рассмотреть их тончайшие детали.
"Это совершенно другой подход к микроскопии, — говорит Бойден. — В отличие от последних 300 лет биоимиджинга, где линза увеличивает изображение света от объекта, мы физически увеличиваем сами объекты". После экспансии ткани исследователи могут видеть больше даже на широко доступном, обычном микроскопическом оборудовании.
Команда Бойдена представила этот подход, названный экспансионной микроскопией (ExM), в 2015 году. С тех пор метод совершенствуется и находит применение в самых разных областях: от изучения болезни Альцгеймера и вирусов до исследования почек, мозга плодовой мушки, семян растений и микробиома.
Истоки ExM
Для разработки экспансионной микроскопии команда обратилась к гидрогелю — материалу с выдающимися водопоглощающими свойствами. Лаборатория предположила, что гидрогели могут сохранять свою структуру, поглощая в сотни раз больше воды, расширяя пространство между своими химическими компонентами.
Были определены четыре ключевых шага для увеличения тканевых образцов:
Инфильтрация ткани гидрогелем. Биомолекулы ткани привязываются к матрице геля.
Химическое размягчение ткани.
Добавление воды. Гидрогель впитывает воду и набухает, равномерно расширяя ткань.
Визуализация. Относительное положение компонентов сохраняется.
В первой статье в журнале Science (2015) команда показала, что, "раздвигая" молекулы, скученные внутри клеток, можно различить детали, которые под стандартным световым микроскопом сливались бы в одно пятно. Обычный предел разрешения светового микроскопа — около 300 нанометров. С помощью ExM команда Бойдена достигла эффективного разрешения около 70 нанометров при четырехкратном расширении.
"Биология в своей основе — наноразмерная наука. Экспансионная микроскопия демократизирует наноимиджинг. Теперь любой может рассмотреть строительные блоки жизни", — отмечает Бойден.
Возможности для ученых
С 2015 года исследовательские группы по всему миру опубликовали сотни работ с использованием ExM. В нейробиологии метод позволил:
- Изучить сложные нейронные цепи.
- Увидеть организацию белков в синапсах.
- Обнаружить изменения, связанные со старением и болезнями.
Метод также оказался мощным инструментом за пределами нейробиологии. Например, Сабрина Абсалон из Indiana University School of Medicine использует ExM для изучения малярийного паразита, чьи внутриклеточные структуры слишком малы для обычной световой микроскопии. Теперь она может наблюдать за сборкой органелл и их изменениями при делении паразита, что открывает новые пути для поиска лекарств.
Доступность метода особенно важна для паразитологии, где много исследований проводится в регионах с ограниченными ресурсами. Благодаря тренингам ученые в Африке, Южной Америке и Азии могут получать сверхвысокое разрешение без очень дорогого оборудования.
Постоянное улучшение
С 2015 года лаборатория Бойдена постоянно совершенствует метод:
- Стандартная техника теперь позволяет лучшее мечение, большее увеличение и более высокое разрешение (разделение объектов менее 20 нм друг от друга).
- Адаптация протоколов для работы с разными образцами: от целых круглых червей до клинических образцов (для выявления ранних признаков болезней).
- Многократное повторное мечение одного и того же расширенного образца позволяет визуализировать десятки разных белков и их взаимное расположение.
- Расширение типов мишеней: теперь можно визуализировать не только белки, но также РНК и липиды. Мечение липидов, формирующих клеточные мембраны, позволяет видеть четкие контуры клеток и отслеживать тонкие отростки нейронов.
"Теперь вы можете получать изображения, очень похожие на электронно-микроскопические, но на обычных световых микроскопах", — говорит Бойден.
Комбинация с другими технологиями
ExM становится еще мощнее в сочетании с другими передовыми методами:
- С решетчатой светлопольной микроскопией (lattice light-sheet microscopy) весь мозг плодовой мушки можно отсканировать с высоким разрешением за несколько дней.
- При in situ секвенировании РНК, закрепленной в гидрогеле, можно точно определить местоположение инструкций для построения белков внутри клеток.
- "Экспансия, по сути, повышает разрешение многих других технологий: масс-спектрометрической, рентгеновской или рамановской визуализации", — отмечает Бойден.
Будущее метода
Через десять лет после первого успеха команда Бойдена продолжает совершенствовать ExM, делая его быстрее, лучше и дешевле. Однако развитие метода теперь движется и силами других лабораторий по всему миру:
- Группа Сильвио Риццоли (University Medical Center Göttingen) адаптировала протокол для определения физических форм белков.
- Команда Дже-Бёма Чанга (Korea Advanced Institute of Science and Technology) научилась расширять целые тела эмбрионов мышей и молодых рыб данио.
- Подход светомической коннектомики (light-microscopy based connectomics), разработанный Йоханном Данцлем (Institute of Science and Technology, Австрия), использует высокое разрешение и молекулярную информацию ExM для картирования нейронных связей.
"Прелесть экспансии в том, что она позволяет увидеть биологическую систему вплоть до ее мельчайших строительных блоков", — говорит Бойден. Его команда намерена достичь физических пределов метода, чтобы увидеть, как все молекулы работают вместе как сеть, — то есть как на самом деле работает жизнь.