Геномная инженерия количественных белковых меток

Запатентованный подход клеточных биологов для детекции и полуколичественного анализа белков — вестерн-блоттинг — может уйти в прошлое. Профессор Свен Эйкерман (VIB/Университет Гента) и коллеги разработали набор универсальных белковых меток, обеспечивающих количественное определение белков с помощью таргетных протеомных методов. Разработка и применение этих новых меток — названных Протеотипическими пептидами для Количественного определения методом SRM (PQS) — описаны в онлайн-журнале с открытым доступом Scientific Reports.

Проблема количественного определения

Получение точных данных о клеточной концентрации белка остается сложной задачей. Основанные на антителах методы, такие как вестерн-блоттинг и ELISA, чувствительны и удобны, но детекция может быть затруднена неадекватными антителами или маскировкой эпитопа. Альтернативные стратегии, такие как селективный мониторинг реакции (SRM), не требуют иммуноаффинных реагентов, а вместо этого используют таргетную масс-спектрометрию для отслеживания уровня экспрессии белка. Однако разработка анализа для SRM остается сложной, поскольку для каждого изучаемого белка необходимо подбирать несколько протеотипических репортерных пептидов.

Концепция универсального анализа

Группа Эйкермана предложила концепцию универсального SRM-анализа на основе белковых меток, которая устраняет необходимость кропотливой оптимизации таргетных протеомных анализов для каждого интересующего белка. Идея заключалась в создании небольшого пептида с оптимальными для триптического расщепления контекстами и оптимальными для SRM-детекции масс-спектрометрическими свойствами.

Поиск идеальных пептидов

Для реализации этой идеи лаборатория объединила усилия с биоинформатической группой Леннарта Мартенса (VIB/Университет Гента) и протеомной лабораторией Криса Геварта (VIB/Университет Гента). Ученые проанализировали протеом гипертермофила Pyrococcus furiosus в поисках уникальных последовательностей с оптимальными характеристиками для масс-спектрометрии. Экстремальная среда обитания этой архебактерии обеспечила уникальный источник пептидов. Для универсальной применимости в широком круге модельных организмов команда искала пептиды, протеотипичные для всех эукариот и всех штаммов E. coli. Были отобраны два идеальных пептида, пригодных для прямой чувствительной детекции и количественного определения в сложных лизатах.

Преимущество нового подхода

Эксперт по SRM Ан Стаес (VIB/Университет Гента) отмечает: «Раньше мне нужно было настраивать SRM-анализ для каждого интересующего белка, что было трудоемко и часто имело низкий процент успеха. Эта сложная разработка анализа теперь устарела».

Внедрение меток в геном

Для введения количественных меток в геном человеческих клеток ученые использовали инструменты геномной инженерии. «С помощью системы CRISPR/Cas9 мы смогли эффективно пометить эндогенные белки в культурах клеток млекопитающих, создав универсальную систему количественного считывания для меченых белков», — комментирует Эйкерман. «Это добавляет мощный новый аспект к редактированию генома. Теперь возможно точное и чувствительное количественное определение эндогенного белка, либо напрямую, либо после его очистки в составе белкового комплекса».