Как дрожжи реагируют на изменения: новый протокол позволяет измерить полный набор уровней белков

Процедура, позволяющая точно измерить уровни более 99% белков, продуцируемых разными штаммами дрожжей Schizosaccharomyces pombe, открывает путь для новых лабораторных применений этого вида. Теперь исследователи смогут определять прямое влияние изменений окружающей среды, стадии жизненного цикла, а также мутаций, делеций и активности генов на этот модельный организм.

Протокол, разработанный Минору Ёсидой и Акихисой Мацуямой из Института перспективных наук RIKEN в Вако совместно с коллегами из Университета Намюра в Бельгии, уже успешно применён вручную для изучения эффекта делеций генов. Исследователи уверены, что его можно легко автоматизировать.

Появление высокопроизводительного секвенирования геномов сделало полные геномные последовательности многих микроорганизмов легкодоступными, что позволяет молекулярным биологам определять их белковые наборы — протеомы. Это открывает возможность изучения самого протеома, в частности, того, как уровни белков реагируют на изменения в генах, возрасте или окружающей среде.

Дрожжи Schizosaccharomyces pombe стали полезной моделью для изучения человеческих генетических систем, поскольку имеют много схожих генов и с ними легко работать в лаборатории. Геном этих дрожжей, состоящий примерно из 5000 генов, был впервые опубликован в 2002 году, но несколько серьёзных препятствий мешали исследователям точно определить уровни всех продуцируемых им белков. Одной из проблем была клеточная стенка дрожжей, затрудняющая экстракцию белков для анализа. В более ранней работе Ёсида и коллеги успешно разработали метод разрушения этих клеточных стенок для подготовки смесей внутриклеточных белков.

Новая процедура позволяет сравнивать протеомы разных штаммов дрожжей — обычно нормального «дикого типа» с генетическим мутантом или штаммом, выращенным в специфических условиях. В частности, она основана на мечении открытых рамок считывания (ORF) — участков хромосом, кодирующих белки — с помощью небольшой метки, которую распознаёт флуоресцентно меченое антитело. Исследователи вводили метки в интересующие штаммы с помощью «массового спаривания», отбирая только потомство дрожжей, содержащее меченые ORF. Уровень каждого белка затем можно было определить с помощью флуоресцентного сканера.

«Сейчас мы используем протокол для изучения молекулярных механизмов старения, — говорит Мацуяма. — Белки, уровни которых воспроизводимо изменяются после того, как дрожжевые клетки прекращают деление, могут предоставить нам маркеры возраста».