Биоинженеры выяснили, почему искусственные стволовые клетки могут давать сбои: ошибки в упаковке ДНК

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS-клетки) перспективны для регенеративной медицины, так как могут превращаться в любой тип ткани и создаются из собственных взрослых клеток пациента, что гарантирует совместимость. Однако процесс превращения взрослых клеток в iPS-клетки несовершенен: после возврата в плюрипотентное состояние эти клетки не всегда правильно дифференцируются обратно во взрослые клетки.

Исследователи из Пенсильванского университета обнаружили одну из причин: процесс репрограммирования не всегда полностью воссоздает способ упаковки генома клетки внутри ядра. Эта трехмерная конфигурация напрямую влияет на экспрессию генов и, следовательно, на функциональность клетки.

Новое исследование показывает, что современные методы могут производить iPS-клетки, не эквивалентные плюрипотентным стволовым клеткам эмбрионов. Некоторые клоны сохраняют паттерны упаковки, частично напоминающие паттерны взрослых клеток, из которых они были созданы.

Исследование под руководством Дженнифер Филлипс-Креминс и аспиранта Джонатана Бигана, опубликованное в журнале Cell Stem Cell, также предлагает способы минимизации этих ошибок упаковки.

Хотя методы репрограммирования взрослых клеток в iPS-клетки существуют уже десятилетие и позволяют избежать проблем с использованием эмбриональных стволовых клеток, клинические исследования iPS-клеток идут медленно и осторожно. Они могут неверно дифференцироваться в нужную ткань. Кроме того, есть опасения, что полученная ткань может иметь непредвиденные генетические аномалии или стать раковой.

Исследователи также заинтересованы в iPS-клетках как способе создания «болезни в чашке Петри». Вместо забора ткани у пациента с генетическим заболеванием (что особенно сложно для мозга) можно использовать iPS-клетки, полученные из его клеток кожи, чтобы вырастить модели органов. Наблюдение за развитием таких тканей может дать ключи к пониманию болезни и стать идеальной платформой для тестирования терапий.

Однако как для клиники, так и для исследований не до конца ясно, какие признаки определяют «высокое качество» iPS-клеток, способных правильно дифференцироваться без генетических аномалий.

«Мы знаем, что существует связь между топологией генома и экспрессией генов, — говорит Филлипс-Креминс, — поэтому мы решили изучить, как генетический материал переконфигурируется в трех измерениях внутри ядра при репрограммировании зрелых клеток мозга в плюрипотентное состояние. Мы обнаружили сложные конфигурации, которые важным образом различаются между iPS-клетками и эмбриональными стволовыми клетками».

Филлипс-Креминс изучает «3D-эпигенетику» — то, как укладка ДНК влияет на экспрессию генов. Классические эпигенетические метки — это химические модификации поверх последовательности ДНК. Однако линейный взгляд на эти метки не раскрывает всей картины, поскольку упаковка генома может сближать удаленные участки ДНК в пространственном и функциональном контакте.

Применив экспериментальные и вычислительные методы, разработанные в лаборатории Креминс, группа смогла выявить ранее невидимые паттерны упаковки в iPS-клетках.

«Предыдущие методы давали данные, аналогичные старому телевизору с крупными черно-белыми пикселями, — говорит Филлипс-Креминс. — Можно было получить размытое изображение и понять, что на экране человек, но трудно было разобрать черты лица. Мы использовали методы для создания высокодетальных карт упаковки генома, чтобы различить тонкие топологические особенности и оценить их сходства и различия между традиционными эмбриональными стволовыми клетками, iPS-клетками и зрелыми дифференцированными клетками».

Метод Бигана для создания высокодетальных карт включает фиксацию ДНК с сохранением ее 3D-структуры до секвенирования. Участки линейной генетической последовательности, далеко отстоящие друг от друга, но пространственно соседствующие при укладке ДНК, химически «склеиваются». В результате две удаленные части линейной последовательности окажутся в одной гибридной молекуле ДНК и будут обнаружены вместе при секвенировании.

Анализ этих гибридных фрагментов позволяет исследователям определить, какие сегменты ДНК соседствуют друг с другом в упакованном состоянии генома. Ключевое отличие подхода лаборатории Креминс — таргетирование только определенных сайтов в геноме, что делает высокодетальный анализ в этих регионах гораздо более достижимым, чем при альтернативных полногеномных подходах. Полученные карты — самые детальные на сегодня карты упаковки генома в iPS-клетках.

Данные секвенирования визуализируются в виде тепловых карт, которые показывают, какие сегменты ДНК пространственно соседствуют в 3D-ядре стволовых клеток.

«Каждый пиксель на наших тепловых картах, — говорит Биган, — представляет частоту взаимодействия любых двух заданных сегментов генома. Частоту контактов можно представить в виде цвета, а весь регион ДНК — в виде тепловой карты. Мы видим интригующие паттерны высокой и низкой интенсивности, и по этим паттернам можно вывести конфигурации упаковки генома».

Исследователи сравнили iPS-клетки с клетками, из которых они были получены, и с эмбриональными стволовыми клетками, которые они в идеале должны точно воспроизводить.

Они обнаружили, что традиционные эмбриональные стволовые клетки и зрелые дифференцированные клетки мозга имеют разительно разные паттерны упаковки генома. Однако, что удивительно, генетический материал iPS-клеток был упакован не так, как у эмбриональных стволовых клеток, а демонстрировал следы 3D-конфигураций клеток мозга, из которых был получен.

«Мы обнаружили заметные различия между тепловыми картами для каждого типа клеток, — говорит Биган. — Наши наблюдения важны, потому что предполагают: если мы сможем приблизить 3D-конформацию генома репрограммируемых клеток к конформации эмбриональных стволовых клеток, то, возможно, сможем создавать iPS-клетки, более точно соответствующие «золотому стандарту» плюрипотентных стволовых клеток, быстрее и эффективнее».

Важно, что исследователи также обнаружили возможность получать iPS-клетки с более точной упаковкой, изменяя среду, в которой они выращиваются. Этот результат дает понимание возможных путей улучшения инженерии iPS-клеток для экспериментов и лечения. Лаборатория Филлипс-Креминс уже проводит эксперименты по направленной инженерии 3D-упаковки генома в стволовых клетках для контроля экспрессии генов по запросу.