CRISPRmap: новый метод для изучения функции генов в клетках и тканях
Лаборатория Гаубломма разработала новый метод оптического скрининга в пуле — CRISPRmap. Он позволяет связать оптические свойства отдельных клеток с направленными генетическими пертурбациями. Оптические фенотипы, обычно недоступные для методов на основе секвенирования (требующих лизиса клеток), включают важную информацию: морфологию клеток, субклеточную локализацию белков, межклеточные взаимодействия, факторы внеклеточного матрикса и организацию ткани.
CRISPRmap позволяет проводить пространственно разрешенный анализ функции генов в тканях, выявляя как клеточно-внутренние, так и клеточно-внешние эффекты пертурбаций, которые недоступны при in vitro исследованиях. Метод открывает новые пути для изучения генов, вовлеченных в рекрутинг иммунных клеток в опухоли, метастазирование, инвазию и ангиогенез.
Результаты исследования опубликованы в Nature Biotechnology.
Проведение таких исследований в формате пула позволяет выполнять высокопроизводительные генетические исследования, измеряя параллельно ответы множества клеток на разные генетические пертурбации. В пульном анализе каждая клетка экспрессирует РНК-транскрипты, несущие штрихкод, который идентифицирует конкретную CRISPR-пертурбацию в этой клетке.
CRISPRmap позволяет считывать оптические штрихкоды в сложных типах клеток и контекстах, ранее недоступных для других методов, включая стволовые клетки, производные нейроны и клетки in vivo в тканевых контекстах. Определив, какой ген подвергнут пертурбации в данной клетке, ученые могут изучать ответ клетки и её микроокружения на эту пертурбацию.
«Наша лаборатория оптимизировала CRISPRmap для совместимости с анализами на основе оптического считывания, что позволяет одновременно проводить мультиплексный профилирование белков и мРНК. Более того, CRISPRmap не зависит от типа генетической пертурбации, открывая путь для изучения направленных мутаций, интерференции и активации генов, эпигенетической модификации и CRISPR-редактирования РНК», — пояснил профессор Джеллерт Гаубломм, корреспондирующий автор исследования.
В коллаборации с лабораторией Чиччиа в Медицинском центре Колумбийского университета авторы применили CRISPRmap для изучения функциональных последствий 292 мутаций в 27 генах, критических для ответа на повреждение ДНК, визуализируя рекрутинг белков репарации ДНК к местам повреждения.
Они оценили эти ответы после воздействия ионизирующего излучения или ДНК-повреждающих агентов, обычно используемых в качестве химиотерапевтических препаратов при раке молочной железы. Профилирование экспрессии и субклеточной локализации десятков белков и видов мРНК примерно в одном миллионе клеток позволило провести детальный анализ влияния вариантов на ответ на повреждение ДНК.
«Этот метод позволил нам идентифицировать миссенс-варианты с неопределенной клинической значимостью, чей ответ напоминает известные патогенные варианты. Таким образом, наш подход может предоставить основу для аннотирования человеческих вариантов с учетом конкретного лечения и помочь в расстановке приоритетов терапевтических стратегий», — описал Цзячэн Гу, первый автор исследования.
Помимо исследований раковых клеточных линий, выращенных in vitro, исследователи продемонстрировали детекцию штрихкода CRISPRmap в раковых клетках в микроокружении опухоли — ключевая цель награды NIH Director's New Innovator Award, полученной лабораторией.
В коллаборации с лабораторией Чана они проанализировали срезы опухолей с детекцией штрихкода CRISPRmap, совместив считывание с мультиплексным окрашиванием антителами для визуализации ангиогенеза, формирования внеклеточного матрикса вокруг опухолевых доменов и транслокации транскрипционных факторов в ядро трансплантированных клеток.
Поскольку CRISPRmap применим для различных CRISPR-модальностей и типов клеток, метод может быть использован в широком спектре биологических и медицинских исследований.
«Мы оптимизировали наш подход для широкой доступности, поскольку он не зависит от реагентов для секвенирования сторонних производителей для детекции штрихкода, красители для считывания можно настроить под доступные исследователям микроскопы, и подход является экономически эффективным», — пояснил Гу.
«Мы полагаем, что это позволит отдельным лабораториям проводить исследования пертурбаций в интересующих их типах клеток, исследуя биологические пути в масштабе, сопоставимом с количеством генов, играющих роль в этом пути», — добавил Гаубломм.
Лаборатория Гаубломма планирует изучить влияние генетических пертурбаций на архитектуру ткани и взаимодействие между клетками в сложных микроокружениях. Дальнейшие исследования могут быть сосредоточены на органоидах, полученных от пациентов, для изучения функции генов в тканевом и болезнь-специфическом контекстах.
«Мы видим, что CRISPRmap сможет выявлять оптические фенотипы в широком диапазоне биологических масштабов: от молекулярных, таких как очаги разрывов ДНК в отдельном ядре, до клеточной реорганизации в целых органах. Подход может быть применен в исследованиях — от фундаментальной биологии до механизмов болезней и оптимизации разрабатываемых терапевтических подходов при нейродегенеративных заболеваниях и раке», — заключил Гаубломм.