CRISPR-sciATAC: новая технология для изучения роли хроматина в раке
Исследователи из лаборатории Невилла Саньяны в Нью-Йоркском геномном центре (NYGC) и Нью-Йоркском университете (NYU) разработали CRISPR-sciATAC — новую интегративную платформу для генетического скрининга. Она одновременно фиксирует CRISPR-опосредованные нарушения генов и доступность хроматина в масштабе всего генома на уровне единичных клеток. Метод, описанный в Nature Biotechnology, использует программируемость системы редактирования генов CRISPR для нокаута почти всех генов, связанных с хроматином, параллельно. Это позволяет глубже понять роль доступности ДНК при раке и редких заболеваниях, связанных с хроматином.
Суть технологии и первое применение
В первой демонстрации метода команда создала CRISPR-библиотеку для нацеливания на 20 генов, модифицирующих хроматин, которые часто мутируют при различных раках (груди, толстой кишки, лёгких, мозга). Многие из этих ферментов являются супрессорами опухолей, и их потеря ведёт к глобальным изменениям в доступности хроматина. Например, потеря гена EZH2 (кодирующего гистонметилтрансферазу) привела к увеличению экспрессии нескольких ранее «замолчанных» генов развития.
«Масштаб CRISPR-sciATAC делает этот набор данных уникальным. Здесь, в едином генетическом фоне, у нас есть данные по доступности, отражающие влияние каждого гена, связанного с хроматином. Это создаёт детальную карту взаимосвязи между геном и тем, как его потеря влияет на организацию генома с разрешением на уровне одной клетки», — сказала доктор Ноа Лисковитч-Брауэр, соавтор исследования.
Атлас хроматина и ключевые находки
В целом команда нацелилась на более 100 генов, связанных с хроматином, и создала «атлас хроматина», показывающий, как меняется геном в ответ на потерю этих белков. Атлас выявил, что разные субъединицы в пределах каждого из 17 нацеленных комплексов ремоделинга хроматина могут оказывать разное влияние на доступность генома. Почти все эти комплексы содержат субъединицы, потеря которых увеличивает доступность, и субъединицы с противоположным эффектом.
Наибольшее нарушение сайтов связывания транскрипционных факторов (важных функциональных элементов генома) наблюдалось после потери белка ARID1A — члена BAF-комплекса. Мутации в белках BAF-комплекса, по оценкам, участвуют в развитии каждого пятого случая рака.
Изучение динамики нуклеосом
Помимо метода CRISPR-sciATAC, команда разработала набор вычислительных методов для картирования динамических перемещений нуклеосом — белковых кластеров, вокруг которых обёрнута ДНК. Большее количество нуклеосом означает плотно упакованную ДНК, менее доступную для связывания с транскрипционными факторами. Именно это команда обнаружила на специфических сайтах связывания факторов, вовлечённых в пролиферацию клеток, после CRISPR-нокаута ARID1A. При нацеливании на другой фермент, модифицирующий хроматин, эти же сайты демонстрировали увеличение расстояния между нуклеосомами, что показывает динамику их позиционирования.
Доступность метода
«Мы действительно сосредоточились на том, чтобы сделать CRISPR-sciATAC доступной методикой — мы хотели, чтобы её могла использовать любая лаборатория. Мы производили большинство ключевых ферментов самостоятельно и использовали простые методы выделения единичных клеток, не требующие микрофлюидики или специальных наборов», — отметил доктор Антонино Монтальбано, соавтор исследования.
Технические аспекты и перспективы
Для разработки CRISPR-sciATAC исследователи использовали смесь человеческих и мышиных клеток, чтобы создать процесс мечения/идентификации, позволяющий разделять и штрих-кодировать ядра клеток, а также захватывать направляющие РНК (sgRNA), необходимые для CRISPR-нацеливания. Метод основан на более ранней работе по single-cell combinatorial indexing ATAC-seq (sciATAC-seq) и использует уникальную, легко очищаемую транспозазу, разработанную в Лаборатории инновационных технологий NYGC. Ключевым техническим препятствием была оптимизация условий эксперимента для одновременного захвата CRISPR guide РНК и фрагментов генома для профилирования доступности при сохранении целостности ядерной оболочки каждой клетки.
«Интеграция профилирования доступности хроматина в полногеномные CRISPR-скрининги даёт нам новую линзу для понимания регуляции генов», — сказал доктор Саньяна, старший автор исследования. — «С CRISPR-sciATAC у нас есть всесторонний взгляд на то, как специфические ферменты и комплексы, модифицирующие хроматин, меняют доступность и управляют взаимодействиями, контролирующими экспрессию генов. Хроматин задаёт сцену для экспрессии генов, и здесь мы можем быстро измерить влияние различных мутаций на хроматин. Мы надеемся, что этот атлас станет широко полезным ресурсом для научного сообщества».