Управление генами с помощью CRISPR демонстрирует высокую специфичность

Исследователи продемонстрировали исключительную специфичность нового метода "включения" и "выключения" последовательностей генома человека без редактирования самого генетического кода.

Изначально открытая как противовирусная система у бактерий, CRISPR/Cas9 сегодня — одна из самых популярных тем в генетических исследованиях. Модифицируя эту систему, учёные могут как редактировать последовательности ДНК, так и контролировать активность генов.

Однако предыдущие исследования показали, что редактирование последовательностей ДНК человека с помощью этой системы не всегда достаточно точно. Эти результаты вызвали обеспокоенность по поводу использования технологии CRISPR для изучения болезней человека.

В качестве потенциального решения некоторые исследователи добавили системе универсальности, используя CRISPR для нацеливания на участки ДНК, которые контролируют активность генов. Но вместо режущего фермента Cas9 они инактивировали его режущую функцию и присоединили к нему белки, контролирующие упаковку генома. Распутывая или плотно сворачивая эти области генома, можно эффективно "включать" и "выключать" их.

Хотя техника показала свою работоспособность, вопрос о её побочных эффектах (off-target effects) не исследовался. Теперь команда учёных из Университета Дьюка показала, что эти методы контроля генов обладают высокой степенью точности, необходимой для фундаментальной науки и медицинских исследований.

Исследование опубликовано онлайн 26 октября 2015 года в журнале Nature Methods.

Преимущество в специфичности

"Главное преимущество CRISPR перед предыдущими технологиями — возможность использовать генетический скальпель вместо кувалды, — сказал Чарльз Герсбах, доцент биомедицинской инженерии в Университете Дьюка. — Многие лаборатории по всему миру используют эти инструменты, предполагая, что получают специфичные эффекты, но не было всестороннего анализа, чтобы это доказать. Наши эксперименты показывают исключительную специфичность, демонстрируя, что технология способна нацеливаться на единичные последовательности генома".

Возможность контролировать "переключатели" генома особенно важна для изучения и потенциального лечения таких болезней человека, как рак, сердечно-сосудистые заболевания, нейродегенеративные состояния и диабет, которые могут быть вызваны мутациями в регуляторных областях генома. Надежда в том, что "перезапись" одного из таких переключателей может выявить и исправить первопричину многих болезней. Это также поможет понять и изменить индивидуальную реакцию людей на лекарства.

Но только если техника CRISPR достаточно специфична.

Решение проблемы побочных эффектов

Вскоре после первого описания CRISPR для редактирования генов человека несколько работ показали, что техника иногда может иметь побочные эффекты (off-target effects). Это создаёт проблемы как для генной терапии, так и для фундаментальных научных проектов, где исследователи хотят изменить функцию конкретных генов, не вызывая непредвиденных побочных эффектов.

Была разработана альтернативная стратегия для включения и выключения областей генома, контролирующих активность генов, без изменения самой последовательности ДНК. В некоторых случаях такие "переключатели" могут контролировать сразу несколько связанных генов, позволяя исследователям "брать аккорды, а не отдельные ноты".

"Оценить специфичность этих инструментов технически очень сложно, — сказал Тимоти Редди, доцент биостатистики и биоинформатики в Университете Дьюка. — Обнаружить изменение в последовательности или активности гена относительно просто, если вы фокусируетесь на одной конкретной области генома. Но чтобы понять, как выключение одного регуляторного элемента влияет на активность и структуру всего генома, требуются более специализированные методы".

Интеграция экспертизы

Герсбах обратился за помощью к Редди и их коллеге Грегори Кроуфорду, которые работают в соседних лабораториях Центра геномной и вычислительной биологии Университета Дьюка.

Редди посвятил карьеру изучению того, как работают генетические "переключатели" в геноме человека, как они различаются у разных людей и каковы последствия этих различий для признаков и болезней человека. Кроуфорд, доцент педиатрии, более десяти лет разрабатывал методы идентификации регуляторных областей в геноме и того, как они различаются между типами клеток, в процессе развития или в ответ на лекарства.

"Современные методы контроля генетических переключателей, включая лекарства, используемые в клинических испытаниях, меняют активность множества переключателей по всему геному одновременно, создавая тысячи побочных эффектов, — сказал Кроуфорд. — Отчаянно необходима технология для манипуляции одним элементом за раз".

Задачей Пратикши Такоре, аспирантки из лаборатории Герсбаха, стала интеграция экспертизы всех трёх лабораторий для изучения специфичности CRISPR в контроле этих "переключателей". Хотя результаты не могут доказать, что каждый эксперимент будет иметь такой же высокий уровень точности, они предоставляют исследователям план для оценки этих эффектов.

"Интегрируя геномику и генную инженерию, мы разработали метод для всестороннего изучения того, как работает эта система генетического "заглушения", а также предложили способы использования технологии в будущем, — сказала Такоре. — Мы также узнали кое-что новое о регуляции генов, и оказалось, что в этом контексте CRISPR может достичь гораздо более высокого уровня специфичности, чем мы ожидали".