Учёные впервые визуализировали работу генетических ножниц CRISPR в реальном времени

CRISPR-Cas — это белковые комплексы, которые бактерии используют для защиты от вирусов. Они распознают чужеродную ДНК с помощью встроенной РНК. Этот механизм, открытый около десяти лет назад, произвёл революцию в генной инженерии и был удостоен Нобелевской премии по химии в 2020 году.

Однако иногда CRISPR-комплексы реагируют и на последовательности, слегка отличающиеся от целевых, что приводит к нежелательным побочным эффектам. Причины этого были плохо изучены, так как процесс нельзя было наблюдать напрямую.

Наблюдение за процессом в наномасштабе

Чтобы понять процесс распознавания, команда под руководством профессора Ральфа Зайделя и Доминика Кауэрта исследовала момент, когда двойная спираль ДНК-мишени расплетается для спаривания с РНК. Ключевым вопросом было, можно ли отследить расплетание 10-нанометрового (нм) участка ДНК в реальном времени.

Для визуализации учёные использовали ДНК-нанотехнологии. Методом ДНК-оригами они создали роторную руку длиной 75 нм с золотой наночастицей на конце. Расплетание 2-нм тонкой и 10-нм длинной последовательности ДНК преобразовывалось во вращение наночастицы по кругу диаметром 160 нм, которое можно было наблюдать под специальным микроскопом.

Этот новый метод позволил наблюдать распознавание последовательности комплексом CRISPR Cascade почти по каждой паре оснований. Оказалось, что спаривание с РНК энергетически невыгодно, и комплекс остаётся нестабильно связанным во время распознавания. Стабильное связывание происходит только после распознавания всей последовательности, после чего ДНК уничтожается. Если последовательность "неправильная", процесс прерывается. Исследование опубликовано в журнале Nature Structural & Molecular Biology.

Результаты помогут повысить точность CRISPR

Учёные показали, что ошибки в распознавании связаны со стохастической природой процесса — случайными молекулярными движениями. "Распознавание последовательности управляется тепловыми флуктуациями в спаривании оснований", — поясняет Доминик Кауэрт.

На основе полученных данных была создана термодинамическая модель распознавания, которая описывает реакцию на отличающиеся последовательности. В будущем это позволит лучше подбирать РНК-последовательности, которые будут распознавать только нужную мишень, оптимизируя точность генетических манипуляций.

Разработанные нанороторы универсальны и могут использоваться для измерения скручивания и крутящих моментов в других CRISPR-Cas комплексах или биомолекулах.