Визуализирован механизм генной инженерии CRISPR-Cas9

Исследователи из Университета Канадзавы и Токийского университета сообщили в Nature Communications о визуализации динамики «молекулярных ножниц» — основного механизма техники генной инженерии CRISPR-Cas9.

Техника CRISPR-Cas9 позволяет разрезать ДНК клетки в заданном месте для удаления или добавления генов. Выбор места разреза определяется молекулой «гид-РНК», связанной с белком Cas9. Команда под руководством Микихиро Сибаты и Осаму Нурэки визуализировала динамику комплекса CRISPR-Cas9, в частности, процесс разрезания ДНК.

Для визуализации учёные использовали высокоскоростную атомно-силовую микроскопию (HS-AFM). Этот метод позволяет сканировать поверхность с помощью миниатюрного кантилевера, преобразуя силу взаимодействия в карту высот. Высокоскоростная установка позволила получать повторяющиеся сканы с частотой, достаточной для создания видео биомолекул в действии.

Ключевые наблюдения:

• Белок Cas9 без связанной РНК гибко принимает различные конформации.
• Комплекс Cas9–РНК имеет фиксированную двухдолевую структуру, что подчёркивает способность гид-РНК стабилизировать конформацию.
• Стабилизированный комплекс Cas9–РНК связывается с заранее выбранным сайтом PAM (protospacer adjacent motif) в ДНК. PAM — это короткая нуклеотидная последовательность рядом с целевым участком ДНК, комплементарным гид-РНК.
• Видео HS-AFM показали, что поиск цели («опрос ДНК») происходит за счёт 3-D диффузии комплекса Cas9–РНК.
• Удалось визуализировать динамику самого процесса разрезания: наблюдались конформационные флуктуации области «молекулярных ножниц» после того, как Cas9–РНК локально расплетает двуцепочечную ДНК.

Эта работа углубляет понимание механизма редактирования генома CRISPR-Cas9. По словам исследователей, «… это исследование предоставляет беспрецедентные детали о функциональной динамике CRISPR-Cas9 и подчёркивает потенциал HS-AFM для выяснения механизмов действия РНК-направленных эффекторных нуклеаз из различных CRISPR-Cas систем».

Справка: CRISPR-Cas9

CRISPR (кластеризованные регулярно расположенные короткие палиндромные повторы) — набор последовательностей бактериальной ДНК, содержащих фрагменты ДНК вирусов, которые ранее атаковали бактерии. Эти фрагменты используются бактериями для защиты от последующих атак. «Cas» относится к CRISPR-ассоциированным генам; Cas9 — это CRISPR-ассоциированный белок с двумя нуклеазными доменами (нуклеаза — это фермент, способный расщеплять нуклеиновые кислоты).

Справка: Атомно-силовая микроскопия

Атомно-силовая микроскопия (AFM) — метод визуализации, при котором изображение формируется путём сканирования поверхности очень маленьким остриём. Горизонтальное движение контролируется пьезоэлементами, а вертикальное преобразуется в профиль высот. Поскольку метод не использует линзы, его разрешение не ограничено дифракционным пределом. В высокоскоростном исполнении AFM позволяет получать видео эволюции образца в реальном времени. HS-AFM ранее успешно применялась для изучения динамики белков. Сибата и коллеги впервые применили HS-AFM для визуализации динамики разрезания ДНК системой CRISPR-Cas9.