Новое исследование раскрывает ключевые этапы работы CRISPR-Cas3 с разрешением, близким к атомарному
Ученые из Гарвардской медицинской школы и Корнеллского университета получили снимки CRISPR с разрешением, близким к атомарному, которые раскрывают ключевые этапы его механизма действия. Результаты, опубликованные в Cell 29 июня, предоставляют структурные данные, необходимые для усилий по повышению эффективности и точности CRISPR для биомедицинских применений.
С помощью криоэлектронной микроскопии исследователи впервые описали точную последовательность событий, когда комплекс CRISPR загружает ДНК-мишень и подготавливает ее для разрезания ферментом Cas3. Эти структуры раскрывают процесс с несколькими уровнями проверки на ошибки — молекулярную избыточность, которая предотвращает непреднамеренное повреждение генома.
CRISPR-Cas3 — это подтип системы CRISPR-Cas, широко используемого молекулярного инструмента для прецизионного редактирования генов в биомедицинских исследованиях. Однако некоторые аспекты его механизма действия, в частности, как он ищет свои ДНК-мишени, оставались неясными, а опасения по поводу непреднамеренных побочных эффектов (off-target) поднимали вопросы о безопасности CRISPR-Cas для лечения заболеваний человека.
Детали этих структур с высоким разрешением проливают свет на способы обеспечения точности и предотвращения побочных эффектов при использовании CRISPR для редактирования генов.
Поиск мишени
CRISPR-Cas — это адаптивный защитный механизм, который бактерии используют для защиты от вирусных захватчиков. Он включает захват фрагментов вирусной ДНК, которые затем интегрируются в геном и производят короткие последовательности РНК, известные как crRNA (CRISPR РНК). Эти фрагменты crRNA используются для обнаружения «врага».
crRNA загружается на ферменты семейства CRISPR, которые действуют как часовые. Если эти рибонуклеопротеиновые комплексы встречают генетический материал, соответствующий crRNA, они разрезают эту ДНК. Подтипы CRISPR-Cas, в частности Cas9, можно запрограммировать синтетической РНК для разрезания геномов в определенных местах.
Чтобы лучше понять, как функционирует CRISPR-Cas, команды сосредоточились на типе 1 CRISPR, наиболее распространенном подтипе у бактерий, который использует рибонуклеопротеиновый комплекс, известный как CRISPR Cascade, для захвата ДНК, и фермент Cas3 для ее разрезания.
С помощью комбинации биохимических методов и криоэлектронной микроскопии они реконструировали стабильный Cascade в различных функциональных состояниях и получили снимки Cascade в процессе захвата и обработки ДНК с разрешением до 3.3 ангстрем.
Увидеть — значит поверить
В CRISPR-Cas3 crRNA загружается на CRISPR Cascade, который ищет очень короткую последовательность ДНК, известную как PAM, указывающую на присутствие чужеродной вирусной ДНК.
Исследователи обнаружили, что при обнаружении PAM Cascade изгибает ДНК под острым углом, заставляя небольшую часть ДНК раскручиваться. Это позволяет 11-нуклеотидному участку crRNA связаться с одной цепью ДНК-мишени, образуя «зародышевый пузырек» (seed bubble).
Зародышевый пузырек действует как предохранительный механизм для проверки соответствия ДНК-мишени crRNA. Если они совпадают правильно, пузырек увеличивается, и оставшаяся часть crRNA связывается с соответствующей ДНК-мишенью, образуя так называемую структуру «R-петли» (R-loop).
Как только R-петля полностью сформирована, комплекс CRISPR Cascade претерпевает конформационные изменения, которые фиксируют ДНК на месте. Это также создает выпячивание во второй, нецелевой цепи ДНК, которая проходит через отдельное место в комплексе Cascade.
Только когда сформировано полное состояние R-петли, фермент Cas3 связывается и разрезает ДНК в месте выпячивания, созданного в нецелевой цепи ДНК.
Результаты раскрывают сложную избыточность, обеспечивающую точность и предотвращающую ошибочное разрезание собственной ДНК бактерии.
Перспективы применения
Структуры CRISPR Cascade без ДНК-мишени и в его пост-R-петлевых конформационных состояниях были описаны ранее, но это исследование впервые с высоким разрешением раскрывает полную последовательность событий от образования зародышевого пузырька до формирования R-петли.
В отличие от похожего на скальпель Cas9, CRISPR-Cas3 действует как шредер, который «пережевывает» ДНК без возможности восстановления. Хотя CRISPR-Cas3 пока имеет ограниченную полезность для прецизионного редактирования генов, его разрабатывают как инструмент для борьбы с устойчивыми к антибиотикам штаммами бактерий. Лучшее понимание его механизмов может расширить спектр потенциальных применений CRISPR-Cas3.
Кроме того, все подтипы CRISPR-Cas используют какую-либо версию формирования R-петли для обнаружения и подготовки ДНК-мишени к разрезанию. Улучшенное структурное понимание этого процесса теперь может позволить исследователям работать над модификацией нескольких типов систем CRISPR-Cas для повышения их точности и снижения вероятности побочных эффектов в биомедицинских приложениях.