Исследование работы CRISPR-Cas9 в живых клетках

Учёные из Медицинской школы Университета Массачусетса в исследовании, опубликованном в The Journal of Cell Biology, раскрыли важные детали о внутренней работе системы CRISPR-Cas9 в живых клетках. Эти данные могут иметь значение для разработки терапевтических средств, использующих этот мощный инструмент редактирования генов.

Недостаток знаний о динамике в клетке

До сих пор мало известно о деталях того, как комплекс CRISPR-Cas9 перемещается по геному живой клетки и находит свою мишень. Понимание этого механизма важно для создания инструментов как для лаборатории, так и потенциально для клиники.

Новый метод наблюдения

Чтобы наблюдать за работой системы CRISPR-Cas9 в живой клетке, исследователи разработали методику мечения направляющей РНК (guide RNA) и белка Cas9 разными флуоресцентными молекулами для одновременного отслеживания.

Ключевые открытия

  • Стабильность компонентов: Направляющая РНК, не связанная с Cas9, оказалась крайне нестабильной и быстро деградирует. Комплекс Cas9 с направляющей РНК гораздо стабильнее: около половины комплексов имеют время жизни в ядре клетки примерно 15 минут, остальные — значительно дольше.
  • Эффективность доставки: Cas9 стабилизирует направляющую РНК. Совместная доставка уже собранного комплекса Cas9-guide RNA в клетку будет эффективнее, чем раздельная, при которой часть РНК успеет разрушиться.
  • Время связывания определяет результат: Продолжительность связывания комплекса Cas9-guide RNA с мишенью на ДНК определяет, произойдёт ли разрезание.
    • При полном совпадении последовательностей комплекс остаётся связанным до 2 часов, и разрезание завершается.
    • При неполном совпадении (мисматче) комплекс задерживается всего на несколько минут, и разрезание нарушается.

Значение для практики

Это знание позволяет потенциально математически предсказать, где может произойти нецелевое разрезание (off-target), основываясь на времени, которое комплекс CRISPR проводит на определённом участке генома. Исследование помогает написать часть «руководства по эксплуатации» для CRISPR в живой клетке.

2016-08-26