Новый метод более чем вдвое повышает эффективность редактирования стволовых клеток
Междисциплинарная группа исследователей под руководством Университета Пенсильвании разработала методы для повышения эффективности CRISPR-Cas9 — техники редактирования генома, получившей Нобелевскую премию в 2020 году. Хотя CRISPR-Cas9 быстрее, дешевле и точнее других методов редактирования генов, у технологии есть ограничения, особенно для применения в целях улучшения здоровья человека.
Исследователи разработали более эффективный и доступный процесс применения систем CRISPR-Cas9 в человеческих плюрипотентных стволовых клетках (hPSCs), полученных из одобренных на федеральном уровне линий. Этот подход, опубликованный 7 сентября в Cell Reports Methods, может значительно продвинуть диагностику и лечение генетических расстройств.
CRISPR-Cas9 позволяет ученым точно нацеливаться на участки генетического кода для изменения ДНК, что открывает возможности для создания новых диагностических инструментов и потенциальной коррекции мутаций.
Проблемы традиционного подхода
- Доставка ДНК-эффекторов CRISPR низкая: только 20–30% целевых клеток получают редактирующую ДНК.
- Обычная РНК, введенная в клетки, может распознаваться как вирус и быстро разрушаться, что сводит на нет попытку редактирования.
Решение: модифицированная РНК (modRNA)
Исследователи изменили способ доставки инструментов редактирования, используя modRNA, которая отличается от плазмидной ДНК химически модифицированным основанием и усиленной структурной поддержкой.
- Эффективность доставки: около 90% клеток получили modRNA после простой трансфекции.
- Время действия: modRNA оставалась на месте достаточно долго для модификации клеток, но не вызывала нецелевой активности.
Повышение выживаемости отредактированных клеток
Когда Cas9 создает двуцепочечный разрыв в геноме, многие клетки воспринимают это как серьезную проблему и самоуничтожаются, а не репарируют себя. Чтобы снизить токсичность Cas9 и помочь отредактированным клеткам выжить, команда ввела небольшой белок, способствующий росту клеток. Это ингибировало гибель клеток и повысило эффективность редактирования Cas9 до 84%.
Применение к другим методам редактирования
ModRNA также повысила эффективность других техник, например, базового редактирования (base editing), которое может выключать гены или корректировать мутации, изменяя один нуклеотид.
- Метод на основе modRNA оказался более чем в 4 раза эффективнее плазмидного: 68% против 16% успешного редактирования генома.
Значение работы
Повышение эффективности и результативности редактирования генов позволит исследователям быстрее понимать функции генов.
«Человеческое тело имеет более 20 000 генов, но мы изучаем функции только около 10% из них. Использование инженерных стволовых клеток из наших высокоэффективных методов редактирования генов может значительно ускорить этот процесс», — отметил руководитель проекта Сяоцзюнь "Лэнс" Лиан.