Укрощение побочных эффектов CRISPR

Система редактирования генов CRISPR-Cas9 может изменять гены в заданных местах, но не всегда действует по плану. Команда LMU разработала простой метод для обнаружения непреднамеренных «целевых» событий и показала, что они часто происходят в человеческих стволовых клетках.

Система CRISPR-Cas9 произвела революцию в молекулярной биологии, упростив целенаправленное изменение генетических последовательностей. Она уже стала незаменимым исследовательским инструментом, и начались первые испытания её терапевтического применения. Как в лабораторных, так и в клинических условиях мутации, вносимые системой, должны быть строго ограничены целевым участком (т.е. мутации в других местах генома должны быть исключены), а само генетическое изменение должно быть запланированным. Однако современные системы CRISPR не обладают абсолютной точностью и могут вносить потенциально вредные мутации как внутри целевого гена, так и в других участках генома.

Исследователи LMU под руководством нейробиолога профессора Доминика Паке из Института исследований инсульта и деменции сообщают о разработке простого метода, позволяющего обнаруживать непреднамеренные изменения в самом целевом гене. Их результаты показывают, что такие «целевые» события происходят с высокой частотой. Таким образом, новый метод представляет собой важный вклад в усилия по повышению точности и эффективности редактирования генов на основе CRISPR в исследованиях и как потенциального средства коррекции мутаций, связанных с генетическими заболеваниями. Новые результаты опубликованы в журнале Cell Reports.

Системы ферментов CRISPR-Cas9 позволяют вносить желаемые мутации в определённые участки генов, поскольку их можно «запрограммировать» на создание двуцепочечного разрыва (DSB) в любом конкретном участке геномной ДНК. Такие разрывы впоследствии восстанавливаются собственным механизмом репарации клетки. Возможность высокоспецифичного нацеливания комплекса CRISPR-Cas позволяет учёным по желанию инактивировать гены или вставлять новые последовательности в место DSB. Однако могут возникать и случайные дополнительные мутации — либо в других, нецелевых участках (внецелевые эффекты), либо внутри самого целевого гена (целевые эффекты).

«Целевой эффект CRISPR может привести либо к снижению, либо к полной потере функции целевого гена», — говорит Паке. «Внецелевые эффекты теперь хорошо изучены, и существуют надёжные методы их обнаружения. Но целевые эффекты были обнаружены совсем недавно — и для их обнаружения не хватало простого и общепринятого метода».

Он и его коллеги представили такой метод, который надёжно сигнализирует о наличии непреднамеренных мутаций в целевом генном локусе. Он основан на установленной методике характеристики генетических вариаций (генотипирования) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), и его авторы называют его количественной генотипирующей ПЦР (qgPCR). Кроме того, они проверяют изменения в участках генома, где последовательности ДНК, унаследованные от матери и отца, отличаются друг от друга.

Команда применила новый метод к индуцированным плюрипотентным стволовым клеткам (iPSC), полученным от пациентов, и проверила наличие и частоту целевых эффектов после использования CRISPR для редактирования генома в заданном месте. iPSC генерируются путём репрограммирования соматических клеток пациентов, чтобы они перешли в новое клеточное состояние. Эти репрограммированные стволовые клетки имеют важное значение для биологических исследований и перспективны для терапии.

«Наш метод показывает, что целевые эффекты CRISPR-опосредованного редактирования генов в человеческих стволовых клетках происходят очень часто. В зависимости от того, какой механизм репарации задействован, до 40% всех обработанных клеток могут нести такие мутации», — говорит Паке.

В экспериментальной модели болезни Альцгеймера (которая воспроизводит значимые черты расстройства в культивируемых клетках) группа также продемонстрировала, что такие CRISPR-опосредованные целевые эффекты фактически задерживают появление симптомов. Это открытие служит ярким примером того, как случаи ошибочного нацеливания могут привести к неверной интерпретации результатов исследований, проведённых на клетках, отредактированных с помощью CRISPR. Авторы рекомендуют использовать новый метод в качестве обязательной меры контроля качества для выявления непреднамеренно модифицированных клеток и повышения надёжности — а значит, и полезности — CRISPR-Cas9.