Исследователи усовершенствовали CRISPR-диагностику и создали миниатюрный бумажный тест

Команда, которая первой представила быстрый, недорогой и высокочувствительный диагностический инструмент на основе CRISPR под названием SHERLOCK, значительно расширила его возможности и разработала миниатюрный бумажный тест, результаты которого видны невооруженным глазом без дорогого оборудования.

Команда SHERLOCK создала простую бумажную полоску для отображения результатов теста на одну генетическую сигнатуру, позаимствовав визуальные подсказки у тестов на беременность. После погружения полоски в обработанный образец появляется линия, указывающая, обнаружена ли целевая молекула.

Эта новая функция прокладывает путь к использованию в полевых условиях, например, во время вспышки заболевания. Команда также повысила чувствительность SHERLOCK, добавила возможность точно определять количество мишени в образце и тестировать сразу несколько мишеней. В совокупности эти усовершенствования ускоряют способность SHERLOCK быстро и точно обнаруживать генетические сигнатуры — включая патогены и ДНК опухоли — в образцах.

Инновации, описанные в журнале Science, основаны на более ранней версии SHERLOCK (сокращение от Specific High Sensitivity Reporter unLOCKing) и дополняют растущую область исследований, использующих системы CRISPR для целей, выходящих за рамки редактирования генов. Работа, проведенная исследователями из Broad Institute of MIT and Harvard и Массачусетского технологического института, может оказать преобразующее влияние на исследования и глобальное общественное здоровье.

"SHERLOCK предоставляет недорогой, простой в использовании и чувствительный диагностический метод для обнаружения нуклеиновых кислот — а это может означать вирус, опухолевую ДНК и многие другие мишени", — сказал старший автор Фэн Чжан. "Усовершенствования SHERLOCK теперь дают нам еще больше диагностической информации и приближают нас к инструменту, который можно развернуть в реальных приложениях".

Исследователи ранее демонстрировали полезность SHERLOCK для ряда применений. В новом исследовании команда использует SHERLOCK для обнаружения внеклеточной опухолевой ДНК в образцах крови пациентов с раком легких и для одновременного обнаружения синтетических вирусов Зика и Денге.

Четкие результаты на бумажной полоске

"Новая бумажная система считывания для SHERLOCK позволяет увидеть, присутствовала ли ваша мишень в образце, без приборов", — сказал соавтор Джонатан Гутенберг. "Это значительно приближает нас к диагностике, готовой к применению в полевых условиях".

Команда предвидит широкий спектр применений SHERLOCK благодаря его универсальности в обнаружении нуклеиновых кислот. "Технология демонстрирует потенциал для многих медицинских применений, включая диагностику инфекций у пациентов и обнаружение мутаций, вызывающих лекарственную устойчивость или рак, но ее также можно использовать в промышленных и сельскохозяйственных целях", — добавил Чжан.

Основы

В основе успеха SHERLOCK лежит CRISPR-ассоциированный белок Cas13, который можно запрограммировать на связывание с определенным участком РНК. Мишенью Cas13 может быть любая генетическая последовательность. В определенных обстоятельствах, как только Cas13 находит и разрезает свою заданную мишень, фермент переходит в режим перегрузки, беспорядочно разрезая другую nearby РНК. Чтобы создать SHERLOCK, команда использовала эту "внецелевую" активность, превратив ее в преимущество, и адаптировала систему для работы как с ДНК, так и с РНК.

Диагностический потенциал SHERLOCK зависит от дополнительных цепочек синтетической РНК, которые используются для создания сигнала после разрезания. Cas13 будет разрушать эту РНК после попадания в исходную мишень, высвобождая сигнальную молекулу, что приводит к результату, указывающему на наличие или отсутствие цели.

Обнаружение нескольких мишеней

Платформа SHERLOCK теперь может быть адаптирована для тестирования нескольких мишеней. Изначально SHERLOCK мог обнаруживать только одну последовательность нуклеиновой кислоты за раз, но теперь один анализ может давать флуоресцентные сигналы для до четырех различных мишеней одновременно. Например, новая версия SHERLOCK может определить в одной реакции, содержит ли образец частицы вируса Зика или Денге. Платформа использует ферменты Cas13 и Cas12a (ранее известный как Cpf1) из разных видов бактерий для генерации дополнительных сигналов.

Повышенная чувствительность

Вторая итерация SHERLOCK также использует дополнительный CRISPR-ассоциированный фермент для усиления сигнала обнаружения, что делает инструмент более чувствительным, чем его предшественник. "С оригинальным SHERLOCK мы обнаруживали одну молекулу в микролитре, но теперь можем достичь в 100 раз большей чувствительности", — объяснил соавтор Омар Абудайе. "Это особенно важно для таких применений, как обнаружение внеклеточной опухолевой ДНК в образцах крови, где концентрация мишени может быть чрезвычайно низкой".